２０１４年４月 农 垦 医 学 Ａｐｒ．２０１４ 第３６卷第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｎｇｋｅｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖ０ｌ－３６ ＮＯ．２ 原位杂交检测ＥＢ病毒的体会 王俊生 孔红ｚ （１．生产建设兵团第二师焉耆医院病理科，焉耆，８４１１００； ２．生产建设兵团第二师库尔勒医院病理科，库尔勒，８４１０００） 【摘要】目的：探讨应用原位杂交技术检测石蜡包埋组织中ＥＢ病毒的方法。方法：收集１５例ＥＢ病毒相关的 石蜡包埋病例，利用原位杂交技术检测ＥＢ病毒。结果：１５例原位杂交检测，ＥＢＥＲ阳性７例（４７％），阳性信号定位 于细胞核，呈棕色，染色较浓，易于辨认。结论：原位杂交方法检测石蜡组织切片中的ＥＢ病毒过程中控制好温度等 过程，其结果具有极高的特异性和灵敏性，并可明确定位，是病理组织学ＥＢ病毒检测的首选方法。 【关键词】原位杂交；ＥＢ病毒；温度 中图分类号：Ｒ３６１￣．２ 文献标识码：Ｂ ＥＢ病毒是人类疱疹病毒第Ⅳ型的简称，为一种 白酶Ｋ消化：甩干切片，将组织周围液体用滤纸吸 嗜人类淋巴细胞的 一ＤＮＡ病毒，属于Ｃ疱疹病毒 干，每张切片滴加适量１×蛋白酶Ｋ工作液（约 科。目前研究表明，ＥＢ病毒与多种肿瘤和非肿瘤性 ５０ Ｌ），室温孵育５分钟。蒸馏水洗涤１×１分钟。 疾病有关。可引起传染性单核细胞增多症，并与伯 擦干。（４）杂交：切片过梯度酒精脱水（７０％，９５％酒 基特（Ｂｕｒｋｉｔｔ）淋巴瘤、鼻咽癌以及多种淋巴瘤的发生 精，１００％酒精），干燥后滴加适量杂交液（约２０ Ｌ）， 有密切关系Ⅲ。ＥＢＥＲ是ＥＢ病毒编码的小ＲＮＡ，是 并加盖玻片（不要有气泡）；放置水湿盒中，５５ｑＣ恒 ＥＢ病毒的表达产物，在ＥＢ病毒感染的细胞核中以 温箱孵育６０—９０分钟（为了激活ＥＢＥＲ及外源单链 高拷贝数存在。根据ＥＢＥＲ的特有序列设计的 探针，为下步杂交做准备）；转至３７￣（２恒温箱孵育 ＥＢＥＲ单链ＤＮＡ探针能特异地与ＥＢＥＲ靶序列互 ４—１６小时（放人含３０％湿盒增效液的湿盒）。建议过 补、杂交，从而检测ＥＢ病毒是否存在。 夜（＜１６小时），以保证低拷贝样本的杂交效果；ＰＢＳ 近年来，ＥＢＥＲ原位杂交作为ＥＢ病毒常用的检 （预温至４８℃）浸泡切片，小心移去盖玻片，ＰＢＳ浸 测手段，该技术灵敏度及特异性高，但也易受多种因 泡５分钟；４８℃ＰＢＳ洗涤３×５分钟（轻微振荡容 素的影响。本文主要探讨原位杂交过程中的影响因 器）；（５）信号放大与显色：甩干切片，滴加适量一抗 素，尤其是温度控制过程的体会。 （约５０ Ｌ），３７℃，水湿盒中孵育３０分钟；３７ｏＣＰＢＳ １材料与方法 浸泡３×２分钟（轻微振荡容器）；甩干切片，滴加适 量二抗（约５０ Ｌ），室温，水湿盒中孵育２０分钟；室 １．１材料 温ＰＢＳ浸泡３×２分钟（轻微振荡容器）；甩干切片， 实验标本１５例均选自本院病理科。标本经 滴加适量ＨＲＰ聚合物（约５０ Ｌ），室温，水湿盒中孵 １０％中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片（３—４ ｍ）， 育３Ｏ分钟；室温ＰＢＳ浸泡３×２分钟（轻微振荡容 进行原位杂交。原位杂交试剂盒购自迈新生物技术 器）；甩干切片，滴加适量ＤＡＢ显色液（约５０ Ｌ），室 有限公司。 温，水湿盒中显色１０分钟。室温ＰＢＳ浸泡３×２分 １．２方法 钟（轻微振荡容器）；自来水冲洗，苏木精复染。梯度 ＥＢＥＲ病毒原位杂交检测方法如下： 酒精脱水，中性树胶封片。 （１）切片处理：将４ ｍ厚度的组织粘附在 以上所有的过程都保持湿润不干片，以减少背 ＡＰＥＳ处理的载玻片上，切片于６５℃烘烤６０分钟 景，滴加试剂量可根据组织大小增减。 以上。（２）脱蜡及水化：按照病理科常规处理。（３）蛋 １４５ 第２期 农垦医学 第３６卷 ２结果 １５例原位杂交检测，ＥＢＥＲ阳性７例（４７％），阳 切片处理，脱蜡水化过程时，预先将恒温箱调至 ５５℃，使温度稳定，待切片滴加杂交液，加盖玻片 后，将切片放入湿盒中，５５℃孵育６０—９０分钟，此过 程是为了激活ＥＢＥＲ及外源单链探针，打开双链 性信号定位于细胞核，呈棕色，染色较浓，易于辨 认，见图１。原位杂交方法检测石蜡组织切片中的 ＥＢ病毒具有极高的特异性和灵敏性，并可明确定 ＤＮＡ，为下步杂交做准备。（２）孵育６０分钟后，将恒 位，是病理组织学ＥＢ病毒检测的首选方法。 图１鼻咽癌ＥＢＥＲ原位杂交检测结果 ３讨论 ＥＢＥＲ是ＥＢ病毒编码的小ＲＮＡ，是ＥＢ病毒的 表达产物，在ＥＢ病毒感染的细胞核中以高拷贝数 存在。检测ＥＢ病毒的存在，是通过ＥＢＥＲ的特有序 列设计的ＥＢＥＲ单链ＤＮＡ探针能特异地与ＥＢＥＲ 靶序列互补、杂交实现的。原位杂交实验技术对实 验温度、时间、试剂配比、滴加顺序及试剂量有严格 的要求，其中对温度的调节尤为重要【ｌ１。适当的温度 有利于杂交过程中探针与底物的结合，利于在清洗 过程中将没有杂交上的探针以及组织周围多余的 杂交液洗涤得更彻底，以免和后面的抗体产生反 应，造成非特异性的背景，温度过高或过低都会影 响实验的反应过程。由于原位杂交仪设备昂贵，实 验室通常使用恒温培养箱代替，这就需要对恒温箱 的温度做相应的调节。 蛋白酶Ｋ消化及切片显色过程可以在室温下 完成，预杂交、杂交及滴加一抗过程则需要严格的 温度控制。根据本实验室条件，相应处理如下：（１）在 １４６ 温箱调节至３７ｃＩ二，孵育４一ｌ６小时（或过夜）。此过程 需根据实验室恒温箱情况，尽快使温度下降至 ３７℃，利于探针与底物ＤＮＡ的牢固结合。ｆ３）预温 ＰＢＳ：根据ＰＢＳ液量，微波炉高火加热１—２分钟，再 用常温ＰＢＳ调节至４８℃，用于浸泡冲洗切片。如在 冬天操作，ＰＢＳ温度降低的较快，可将烧杯放入保温 装置中，清洗玻片的容器等也需提前预热。（４）将剩 余ＰＢＳ放人之前设置３７ｃｃ的恒温箱中，用于滴加一 抗过程中冲洗玻片。 此过程的关键在于控制ＤＮＡ双链的解链温 度，也就是ＤＮＡ随着变性温度的升高，杂交阳性信 号数量及强度均明显增多、增强［２１。研究表明，细胞 靶ＤＮＡ分子解链达５０％，特异探针即可与之杂交， 但由于双链ＤＮＡ解链不充分，且探针结合量较少， 所以探针携带的标记也少，显色信号强度较弱，但 多数靶ＤＮＡ仍能被检测。随着变性温度的升高，双 链解开增多，探针结合量增大，显色也增强［引。但解 链温度过高则会增加探针与底物ＤＮＡ的非特异性 结合，出现假阳性或较深的背景。 此实验过程只用一台恒温箱，一台微波炉，节 约了成本，简化了步骤。实验结果通过阳性及阴性 切片比较，结果可靠稳定。 参考文献： …１ 周祥祯，莫祥兰，黄振录，等．成熟Ｔ和ＮＫ细胞淋巴瘤与ＥＢ病 毒感染关系的探讨［Ｊ］．中国临床新医学，２０１２，５（８）：７４５—７４７ ［２】 李琳，田玉旺，朱红艳，等应用ＥＢＥＲ原位杂交检测ＥＢ病毒的 体会［Ｊ】．诊断病理学杂志，２０１ １，４（１ ８）：３ １ １ ［３］ 吕亚利，张杰．原位杂交变性温度对杂交信号强度的影响【ＪＪ冲 华病理学杂志，１９９５，２４（１）：６２ 【收稿日期：２０１４—０３—１０］
