微载体培养动物细胞技术的研究与进展
摘要：
微载体是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。微载体具有比表面积大等优点，在微载体培养技术中具有决定性作用。而微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术,现已广泛应用于组织工程领域\"组织工程生物反应器系统能使细胞体外培养条件接近体内环境。报告就近年来制备微载体的生物材料和方法探究技术以及其在培养动物细胞的研究进展做一综述，为微载体培养技术和组织工程的研究提供理论基础。
关键词：微载体、载体类型、细胞培养、综述文献
引言：
荷兰学者van Wezel 于1967年首先创立了。微载体培养动物细胞技术。在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。20世纪80年代，微载体出现了商品化。Famarcia公司利用中性葡聚糖凝胶表面偶联正电荷基团开发出Cytodex 1、Cytodex 2和Cytodex 3系列商品，但这些微载体由于通过特殊处理都不具有降解性或降解性较差，且价格昂贵。而理想的微载体则应具有良的生物相容性、降解可吸收性。因此，优质微载体生物材料的开发仍是当前研究热点。本文综合分析近年来国内外微载备材料和方法的研究进展，为细胞微载体培养技术和组织工程的研究提供理论基础。
1 资料和方法：
1.1 资料来源
由第一作者在CNKI进行检索。网址：http://www.cnki.net/。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“microcarrier，biomaterials cellculture, tissue engineering”；中文检索词为“微载体，生物材料，细胞培养，组织工程”。
1.2 入选标准
纳入标准：①微载体材料、制备工艺及性能的研究。②微载体细胞培养的研究。③动物实验及临床应用。
排除标准：①与此文目的无关。②较陈旧的文献。③重复同类研究。
1.3 质量评估
基础研究和动物实验研究原著126篇，综述45篇，述评1篇，临床研究5篇。
2 结果：
2.1 纳入文献基本情况
初检得到158篇文献，中文107篇，英文51篇。阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与此文无关106篇，内容重复性的研究37篇，共保存15篇文献做进一步分析。
选取最具代表性的5篇文章进行具体分析。第1篇是对微载体培养技术的研究与进展的综述性文章，第2~3篇研究了壳聚糖球形多孔微载体在组织形容性和血液相容性评价的应用。第4篇研究了微载体细胞培养技术，第5篇研究了超微载体的改进与应用。
2.2 结果描述
2.2.1微载体细胞培养技术：
所谓微载体是指直径在60-250μm，能够适用于贴壁细胞生长的微体。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。而微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术,现已广泛应用于组织工程领域\"组织工程生物反应器系统能使细胞体外培养条件接近体内环境。
微载体系统(microcarrier symem，MCS)用于动物细胞大规模培养具有显著的优点：① 兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养；② 细胞所处环境均一，放大容易；③ 环境条件(温度、PH、c0z，P0z等)容易测量；④ 具有较高的表面积体积比；⑤ 培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。经过二十几年的发展，该技术较中空纤维(hollow fiber)、微囊(microencapsu： lation)等发展得更为完善和成熟。目前生产规模巳达几千升甚至上万升；而且细胞培养的密度也很高(批式培养可达5～6×10 cells／ml；灌流培养可达4～10 eells／m1)。
2.2.2微载体的性能要求：
组织工程种子细胞主要为贴壁依赖性细胞，其只有黏附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。影响细胞贴附和铺展的主要因素是
二价阳离子和吸附糖蛋白。除上述两因素外，对粒径、表面光滑程度、与细胞分离难易、重复使用性等方面均有要求。
2.2.3微载体的制备材料：
早期微载体多采用合成聚合物，如PHEMA、葡聚糖等。合成聚合物制备的微载体重复性和力学性能可以达到较高水平，但缺乏细胞识别位点，影响细胞在其表面黏附、生长。天然聚合物及其衍生物因其取材方便、生物相容性好且价格低廉日渐成为微载备材料的首选。常用的有明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物以及海藻酸盐等。明胶是胶原蛋白经温和、不可逆降解的产物，生物相容性好。胶原是一类可引导组织再生的生物材料，无抗原性、可参与组织愈合过程。Hillegas等在聚苯乙烯微球表面包覆一层胶原后表现出很好的效果。纤维素是以1,4-葡萄糖苷键连接的、由β-D-砒喃葡萄糖元组成的一种均聚多糖。壳聚糖是甲壳质脱乙酰后的产物，其分子链之间可以形成许多氢键，分子中β(1，4)糖苷键为其提供刚性和稳定性；氨基提供弱正电性；乙酰基提供疏水性；羟基具有良好的亲水性，但又不溶解于水。用壳聚糖制备的细胞培养微载体已见报道[3]。藻酸盐是带有二价阴离子的天然线性多糖，由1-4(直链型键合)的α-L-古洛糖醛酸(G单元)和β-D-甘露糖醛酸(M单元)残基组成的共聚物。研究表明，培养在海藻酸盐载体上的软骨细胞可以合成与天然软骨相似的细胞外基质 。
2.2.4微载体的类型：
根据物理学特性主要分为固体微载体、液体微载体和超微载体三类，以第一种为常见，又可分为实心微载体和大孔/多孔微载体。
实心微载体：实心微载体易于细胞在微球表面贴壁、铺展和病毒生产时的细胞感染 ，
Cytodex系列是当前应用较为广泛的一种 。实心微载体的制备多采用悬浮聚合的方法， Piskin等用该法制得PDMS-OH微载体，直径约为200 µm。Li等 采用乳化法制备壳聚糖/明胶微载体。该微载体交联性好且孔径在50~200 µm之间。张立国等采用悬浮交联方法，利用甲苯-四氯化碳作有机分散介质，戊二醛作交联剂，通过对壳聚糖浓度和戊二醛用量等条件制备微载体。结果显示，鼠肝细胞在微载体上保持良好的球形状态，白蛋白分泌可维持7 d以上。刘成圣等以羧甲基壳多糖为材料，经有机溶剂分散、甲醛和戊二醛协同偶联等一系列处理过程制备新型微载体CX-2，平均粒径为142.95 µm。实验表明，BB细胞能较好地黏着于CX-2微载体上，24~72 h期间细胞增殖速度快，120 h时细胞已呈现多层次生长状态。Gabler等 [采用乳化法制备PLGA微载体，控制聚合物浓度和搅拌速度，微球尺寸为40~330 µm。结果表明软骨细胞在该微载体培养3~5 d内细胞存活率高达100%，且微载体维持3个月不降解。
实心微载体比表面积和可获得的细胞浓度均较小，细胞易受搅拌、球间碰撞、流动剪切力等动力学因素破坏。大孔微载体可广泛应用于搅拌釜生化反应器，且在灌流反应器中可保持数月的良好生产力，能在降低培养基血清含量的同时保证细胞和目的产物的产量。
多孔微载体：该微载体的制备关键在于制孔，常见的制孔方法有成孔剂析出法和气体发泡法。成孔剂有盐、糖类、冰晶等。后者常用的气体为CO2。Nam等使用碳酸氢铵为发泡剂和致孔剂，制备出支架的孔径在100~500 µm之间且孔隙连通性良好，然而，孔隙间连通通道的形态和大小不能控制，也不能保证孔隙间全部连通。Shastri等利用固态烃类化合物为致孔剂。Hacker选用与细胞相容性良好的甘油三酯为致孔剂，制备出了孔隙形态为球形的高孔隙率三维支架。Chen等利用喷雾技术制备出球形冰粒致孔剂，采用溶剂浇铸/粒子沥滤技术获取三维组织工程支架。王忆娟等以石蜡为制孔剂，制得表面多孔的明胶微载体。
马列等采用冻干法构建胶原/壳聚糖多孔支架，并通过戊二醛交联获得良好的抗细胞收缩稳定性和细胞相容性。接种成纤维细胞后，其MTT活性随着培养时间的延长而渐增，细胞在该支架中不断增殖。王暾等采用双乳化溶剂挥发技术制备聚丙交酯(PDLLA)多孔微载体。通过改变内水相中碳酸氢铵溶液浓度，调节微载体的孔径和孔隙率。扫描电镜观察及粒度分析显示：微载体表面开孔、内部相互连通，粒径在(335±65) µm范围内，内部孔径20 µm左右，孔隙率达80%以上。体外细胞培养显示骨髓基质干细胞在微载体表面及内部能有效黏附并均匀生长。Kim等以碳酸氢铵为制孔剂，采用双乳化技术制备PLGA微球。随着碳酸氢铵浓度的增加，微载体孔径可高达20 µm左右，确保细胞的渗透和接种。将NIH3T3细胞黏附至其内部孔并分化。Gustafson等制备了直径为133~321 µm，孔径为20 µm的明胶微载体。角化细胞培养结果显示，其在明胶微载体表面和孔洞中均能很好地黏附和分化。
液体微载体：有研究开发了氟碳化合物液膜微载体。其微球形成、细胞贴壁、培养均在搅拌下进行，当达到培养目的时停止搅拌即可。通过混合物的离心分相使细胞游离地悬浮于有机相和培养基相之间，用移液管即可方便移出，克服了固体微载体吸附血清、易于变性等缺点。
超微载体：体积微小、粒径由几百微米到几十纳米，用于装载、保存和运输特定化学物质、进入特定的反应区域或者透过皮肤进入人体组织的一类载体的总称。该载体主要应用于化妆品领域和药物载体方面，有时可作为反应载体。
目前研制的主要的超微载体有微乳液、微胶囊、球形液晶、脂质体和纳能托。微乳液的直径为10~100 nm，一般由水、油脂、表面活性剂和助乳化剂制成，是一种热力学稳定的分散体系。微胶囊是用成膜材料把固体、液体或气体包覆形成的微小粒子，粒径为5~200 µm。成膜材料通常是由蜡、树胶、天然高分子与合成高分子物质构成，常用的有
明胶、羧甲基纤维素等。该种球形液晶属于溶质液晶，是一种多层结构的表面活性剂的聚集体。其以水为溶剂，表面活性剂烷基苯磺酸钠和月桂醇聚氧乙烯(-9)醚为溶质，在临界以上温度制成饱和溶液，加入一些盐形成的悬浮聚集体且运载能力远高于微乳液。脂质体是由类脂组成的双层分子的空心球。根据形态，脂质体可分为3种：多层脂质体、大的单层体和小的单层体。其主要制备原料有磷脂、胆固醇、聚苯乙烯烷基酯和聚苯乙烯烷基酯蔗糖二脂等。脂质体具有亲油、亲水性，是目前医药学及化妆品领域中非常有用的一种载体。纳能托是一种由卵磷脂和辅助表面活性剂以一定比例组成的单层膜状机构的纳米胶体，平均粒径25 nm。其在化妆品的配方、贮存、运输以及消费者使用过程中保持较高的稳定性。
其中最具代表性的纳米微载体由于在催化化学、材料制备、生物医药等多方面有着极为重要而广泛的应用价值,长期以来一直是科研领域研究的热点\"本论文将有机功能分子的光化学转变应用到环境敏感全亲水性嵌段聚合物的超分子组装研究中,通过研究有机光化学转变对两亲聚合物组装和解组装行为的影响规律,探索具有光控功能的新型智能微载体的构筑。
2.2.4微载体的改性：
微载体须具有细胞易于黏附的表面，因而在制作微载体时必须考虑其表面亲水性及电荷特性。常用的改性方法有化学改性法、等离子体法和表面修饰法等。化学改性法是指通过共聚、接枝等方法来改变材料的组成，同时获得具有良好细胞亲和性表面的方法。等离子体改性法是指在微载体表面引入特定的官能团或其他高分子链。表面修饰法是指在微载体表面固定一些贴壁因子、多聚赖氨酸、胶原蛋白等，以提高细胞的黏附性。
Lao等采用乳化法制备直径为74~150 µm的聚乳酸微球，通过氨解技术在聚乳酸微
球表面引入自由氨基，利用戊二醛将氨基转化为醛基，再采用接枝涂层技术将壳聚糖固定到微球表面，制备出壳聚糖表面改性的聚乳酸微载体。结果表明，该微载体有很强的促进细胞黏附和分化能力且保留软骨细胞的分泌功能。同时，细胞的黏附能力和分化能力随着壳聚糖涂层量的增加而增强。吴晨等利用液体石蜡作分散介质，戊二醛作交联剂，制备出粒径为300~500 µm，孔径为50~70 µm，孔隙率为86%的大孔壳聚糖微载体，以乳糖对微载体进行修饰。结果显示，肝细胞在微载体上形成聚集体且保持良好球形。Wu等以壳聚糖为原料，采用悬浮交联和冻干的方法制备微载体。微载体的粒径在300~500 µm，平均孔径为50 µm，孔隙率为86%。分别用乳糖和麦芽糖对微载体进行修饰。结果表明，鼠肝细胞在经乳糖修饰的微载体上的代谢活动更高。Wang等以结兰胶为材料，采用乳化法制备微载体并利用氧化还原交联处理精确控制微载体尺寸在可注射范围内，同时确保其结构的稳定性。表面嫁接明胶后，形成“TriG”微载体。结果显示，人真皮细胞在“TriG”微载体表面分布均匀并保持良好的分化能力，10 d之内传代3次。人胎儿造骨细胞也达到理想的存活率和造骨能力。Lu等以羧甲基壳聚糖为基材，采用相分离和温度控制冷凝法制备纳米纤维胶原表面涂层的壳聚糖多孔微载体(CMC-MCs)。共聚焦显微镜观察显示，接种3 d后，软骨细胞聚集成团。7 d培养后， CMC-MCs彼此之间黏结形成组织类似物。
2.2.5微载体培养动物细胞技术应用成果
微载体技术应用于动物细胞大规模培养技术已生产了一些具有重要实用和商业价值细胞产品 这些高技术产品大致可分为四类：
① 疫苗，包括口蹄疫苗、狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛白血病疫苗、麻疹疫苗等，是在严格的防护和安全措施下生产的。
② 干扰素包括IFN—a、IFN-p、IFN一7 英国Celheeh公司采用自动气升式培养系
统生产的a取7干扰素产品早已行销全世界。
③单克隆抗体产品种类多，应用面广，潜在市场巨大。目前，单抗在美国发展最快，早在1987年，美国食品与药物管理局(FDA)就已批准百余种单抗诊断试剂和一种单抗治疗试剂投放市场。
④ 基因工程产品 包括血纤维蛋白溶酶原激活剂(t—PA)、凝血因子(Ⅶ 、Ⅸ)、蛋白质C、免疫球蛋白(G、A、M)、促红细胞生成素 (EPO)、激肽释放酶、人生长激素(hGH)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、疟疾和血吸虫抗原、尿激酶原(Pro—UK)和尿激酶(UK)等经过长期发展。
2.2.6微载体技术发展存在的问题
商品化的微载体虽然很多,但至今没有哪一种微载体适用于培养各种类型的细胞。选择何种类型的微载体要从以下几个方面考虑:微载体的价格;特殊细胞对微载体表面的特殊要求;收集细胞的方式,是否希望将微载体溶解, 比如用胰蛋白酶/EDTA溶解明胶微载体、用胶原酶溶解胶原微载体,从而得到高质量的细胞悬浮液。经验表明,对于每种特定的细胞系,在大规模培养之前,有必要使用几种不同的微载体先进行小规模培养,认清不同的微载体在细胞产量、蛋白质表达和培养寿命等方面所存在的差别。
结论：
综上所述，微载体材料仍以合成聚合物居多。这种微载体重复性和力学性能可以达到较高水平，但缺乏细胞识别位点，www.CRTER.org影响细胞在其表面的黏附、生长。天然聚合物则能弥补这一缺点。壳聚糖因其良好的生物学性能成为制备材料首选。虽然国内
外研究人员在微载体的研究与制备方面做了很多工作，但迄今仍与临床应用有一定的距离。目前的主要工作是对微载体材料进行表面改性来调节其力学和生物降解性能。为细胞微载体培养技术和组织工程的发展提供理论基础，推进该技术的广泛应用。
理想的微载体应具有的特性是：(1)微载体须不含有能毒害细胞的成分。(2)微载体须与细胞有良好的相容性，使细胞容易贴壁。(3)微载体密度应略大于培养基，一般要在1.03-1.05之间，最大不宜超过1.1，即经轻度搅拌微载体能悬浮在培养基中，停止搅拌又能较快地沉降下来。（4)微载体粒径在40-120μm(干态)范围，经生理盐水溶胀后增大到60-250μm，粒度分布要均匀，径差不大于20-25μm，表面光滑以利于细胞铺展。 (5)微载体须具有良好的光学透明性，便于显微镜观察细胞生长情况。 (6)能在PBS中耐120-1250C ,20-30min热压灭菌。 (7)基质应是非刚性材抖，避免在培养过程中相互碰撞而损伤细胞．(8)不吸收培养基中的营养成分，特别是血清。(9) 收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白制 品分离纯化。 (10) 价廉，能重复使用。
传统乳化法制备微载体存在一定的缺陷，如不能定量控制微球的粒径等。高压静电技术因其成囊性好，粒径可控性强而满足要求。以冰晶作为制孔剂，采用冷冻干燥技术制备多孔微载体，通过对冷冻干燥过程中的参数优化控制，确保微载体性能达到临床要求。新型微载体要兼备材料学和生物学的特性。
展望未来,今后微载体系统大规模细胞培养技术发展的总方向是: （1）研制细胞生长性能优良、吸附细胞容易并能重复使用的新型微载体; (2)研制规模化生物反应器和剪切力小、混合性能好的新型细胞培养系统; (3)设计新的适合于各个体细胞株 (系)的无血清、无蛋白培养基; （4）将生物力学和材料科学的相关成果移植于细胞工程领域,提高细胞大规模培养的仿生化、自动化和精巧化水平。
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