(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104531782 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.04.22
(21)申请号 201410845465.7(22)申请日 2014.12.31
(71)申请人南京工业大学
地址211816 江苏省南京市浦口区浦珠南路
30号(72)发明人陈可泉 王震 刘泽蒙 肖文
李艳 何珣 欧阳平凯(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
代理人李纪昌 曹翠珍(51)Int.Cl.
C12P 7/40(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页
(54)发明名称
一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法(57)摘要
一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，以产琥珀酸放线杆菌为菌株在微氧环境下发酵产丙酮酸，具体包括：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液；步骤2，对发酵罐、碳源补料罐、种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理；步骤3，取灭菌后的血清瓶接入种子培养基，通入CO2后再接入产琥珀酸放线杆菌培养后作为发酵菌种；步骤4，在灭菌后的发酵罐接入发酵培养基，通入气体再接入发酵菌种后，通过通气量、搅拌转速、初糖浓度和补糖浓度，改变进气成分和pH调节剂发酵得丙酮酸。以野生型菌株为生产菌株，菌株性能稳定，产率高，工艺简单，成本低廉，具有良好的市场前景。 C N 1 0 4 5 3 1 7 8 2 A CN 104531782 A
权 利 要 求 书
1/1页
1.一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：以产琥珀酸放线杆菌为菌株在微氧环境下发酵产丙酮酸。
2.根据权利要求1所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，配种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液；步骤2，对发酵罐、碳源补料罐、种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理；
步骤3，取灭菌后的血清瓶，接入种子培养基，通入CO2后再接入产琥珀酸放线杆菌，摇床培养后作为发酵菌种；
步骤4，在灭菌后的发酵罐接入发酵培养基，通入气体，再按照接种量体积比为3~10%接入发酵菌种后，通过通气量、搅拌转速、初糖浓度和补糖浓度，改变进气成分和pH调节剂，发酵30~72h得丙酮酸，发酵全程pH为6.5~7.5，温度为35~40℃。
3.根据权利要求2所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述步骤1的种子培养基成分包括：葡萄糖，酵母膏，玉米浆，NaHCO3，NaH2PO4·2H2O，K2HPO4·3H2O，pH 7.0；发酵培养基成分包括：葡萄糖，酵母膏，玉米浆，乙酸钠，KH2PO4，MgCl2·6H2O，CaCl2，NaCl，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O，pH 7.0；碳源补料培养液：葡萄糖、蔗糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液。
4.根据权利要求2所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述步骤4的进气成分为空气或者CO2 和空气的混合气，所述通气量为 1~3 vvm。
5.根据权利要求4所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述CO2
和空气的混合气的体积比为1:5、1:3或1:1。
6.根据权利要求2所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述步骤4的搅拌转速为50~500 r/min，所述发酵培养基的体积为0.05~50000L。
7.根据权利要求1所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述产琥珀酸放线杆菌为产琥珀酸放线杆菌NJ113或产琥珀酸放线杆菌130Z。
8.根据权利要求2所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述pH调节剂为碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁中的一种或者多种。
9.根据权利要求3所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基中糖为葡萄糖、蔗糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液中的任一种。
10.根据权利要求2所述的用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，其特征在于：所述步骤4的初糖浓度为30~150 g/L，补糖浓度为30 g/L。
2
CN 104531782 A
说 明 书
一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法
1/4页
技术领域
[0001]
本发明涉及丙酮酸制备领域，具体涉及一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方
法。
[0002]
背景技术
丙酮酸（Pyruvate）,又称2-氧代丙酸、a-酮基丙酸或乙酰基甲酸，是最重要的a-氧代羧酸之一。丙酮酸在生物能量代谢中具有十分重要的作用，在无氧分解下有各种变化形式，如肌肉产生乳酸、酵母的酒精发酵和植物组织在无氧状态下生成乳酸或乙醇等，而所有形成丙酮酸的反应途径是完全相同的，并且在有氧状态下分解，通过三羧酸循环被完全氧化。可以认为这是获得能量最有效的途径。在这个意义上，丙酮酸位于无氧分解和有氧分解的交界点上，是极为重要的中间产物。丙酮酸还是合成多种化合物的前体，用途极为广泛，如：（1）制药工业：用于酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴；合成 L-半胱氨酸、L-亮氨酸、维生素 B6和 B12等；与乳酸、锂构成人工胰脏；作为体外传感器测定葡萄糖的含量。（2）生化研究：用于伯醇及仲醇的检定；转氨酶的测定；脂肪族胺的显色剂等。（3）农用化学品：合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、谷物保护剂等多种农药的起始原料。（4）细胞培养：与乳酸组成抗氧化剂，降低对细胞的伤害；是动物细胞培养的重要底物。（5）食品工业：GB2760-1996 规定为酸味添加剂。近年来由于在减肥上有特效而受到西方消费者青睐。[0004] 目前生产丙酮酸的方法主要有酒石酸脱水脱羧法、乳酸催化氧化法、羟酯丙酮法、电化学合成法、乳酸乙酯空气氧化法、生物发酵法以及酶转化法。国内生产丙酮酸酸的厂家主要有浙江台州兴业化工厂等少数十几家企业，年生产能力约 1000 吨，而且主要使用的是落后的酒石酸法。资料显示能直接产生丙酮酸的菌种主要有以下各属：（1）细菌及放线菌：Acinetobacter（不动杆菌属），Schizophyllum（裂褶菌属），Enterobacter（肠杆菌属），Enterococus（肠球菌属），Escherichia（埃希氏菌属），Pseudomonas（假单孢菌属）（2）；酵母菌：Debaryomyces（德巴利酵母属），Candida（假丝酵母属），Saccharomyces（酵母属），Torulopsis（球拟酵母属）等。
[0003] [0005]
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，发酵工艺简单，产率高。[0007] 为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：
一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法，以产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus [0006]
succinogenes ）为菌株在微氧环境下发酵产丙酮酸。
[0008]
上述用放线杆菌微氧产丙酮酸的方法，包括以下步骤：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液；
3
CN 104531782 A
说 明 书
2/4页
步骤2，对发酵罐、碳源补料罐、种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理；
步骤3，取灭菌后的血清瓶，接入种子培养基，通入CO2后再接入产琥珀酸放线杆菌摇床培养后作为发酵菌种；
步骤4，在灭菌后的发酵罐接入发酵培养基，通入气体，再按照接种量体积比为3~10%接入发酵菌种后，通过通气量、搅拌转速、初糖浓度和补糖浓度，改变进气成分和pH调节剂发酵30~72h得丙酮酸，发酵全程pH为6.5~7.5，温度为35~40℃。[0009] 作为优选的是，所述步骤1的种子培养基成分包括：葡萄糖，酵母膏，玉米浆，NaHCO3，NaH2PO4·2H2O，K2HPO4·3H2O，pH 7.0；发酵培养基成分包括：葡萄糖，酵母膏，玉米浆，乙酸钠，KH2PO4，MgCl2·6H2O，CaCl2，NaCl，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O，pH 7.0；碳源补料培养液：葡萄糖、蔗糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液。[0010] 作为优选的是，所述步骤4的进气成分为空气或者CO2 和空气的混合气，所述通气量为 1~3 vvm。
[0011] 作为进气成分的优选是，所述CO2 和空气的混合气的体积比为1:5、1:3或1:1。[0012] 作为优选的是，所述搅拌转速为50~500 r/min，所述发酵培养基的体积为0.05~50000L。
[0013] 作为优选的是，所述产琥珀酸放线杆菌为产琥珀酸放线杆菌NJ113或产琥珀酸放线杆菌130Z。
[0014] 作为优选的是，所述pH调节剂为碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁中的一种或者多种。[0015] 作为优选的是，所述发酵培养基中糖为葡萄糖、蔗糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液中任一种。[0016] 作为优选的是，所述步骤4的初糖浓度为30~150 g/L，补糖浓度为30 g/L。[0017] 有益效果
本发明利用野生型放线杆菌进行丙酮酸发酵，菌株稳定，发酵方式简便新颖，发酵工艺简单，单位菌株丙酮酸产率高，缩短了发酵周期，为微生物发酵法生产丙酮酸的工业化提供了简单经济的发酵工艺。
具体实施方式
[0018] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式本发明。
[0019] 实施例1
一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法,包括以下步骤：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液，配方如下：种子培养基(g·L-1)：葡萄糖10(分消)，酵母膏5，玉米浆 5，NaHCO3 10，NaH2PO4·2H2O 9.6，K2HPO4·3H2O 15.5，pH 7.0；
发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖40(分消)，酵母膏10，玉米浆10，乙酸钠 1.36，KH2PO4 3，MgCl2·6H2O 0.2，CaCl2 0.2，NaCl 1，Na2HPO4·12H2O 0.31，NaH2PO4·2H2O 1.6，pH 7.0； 碳源补料罐培养液(g·L-1)：葡萄糖750；
4
CN 104531782 A
说 明 书
3/4页
步骤2，取发酵罐、碳源补料罐、种子培养基、发酵培养基、碳源补料罐培养液以及100ml的血清瓶在121℃下灭菌15分钟，备用；
步骤3，取灭菌后的血清瓶，接入20ml的种子培养基，通入CO2 ，再接入产琥珀酸放线杆菌NJ113，摇床37℃转速为180 rpm/min下培养10小时，作为发酵菌种；
步骤4，将灭菌后的发酵罐接入600ml的发酵培养基，利用储气罐控制空气的通气量为1 vvm，搅拌转速为200 r/min，按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初糖浓度为50g/L，当培养基糖耗完，使用碳源补料罐一次性添加糖，使糖浓度达到30g/L，全程使用碳酸钠控制pH为6.5，发酵温度：37℃，发酵72h结束。[0020] 实施例2
步骤1至步骤3同实施例1，其中碳源补料罐培养液为200g/L蔗糖。[0021] 步骤4，将灭菌后的发酵罐接入600ml的初始发酵培养基，利用储气罐控制CO2 和空气的混合气（体积比为1:5 ）的通气量为2 vvm，搅拌转速为50 r/min，按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初糖浓度为150g/L，当培养基糖耗完，使用碳源补料罐一次性添加糖，使糖浓度达到30g/L，全程使用氢氧化钠控制pH为6.5，发酵温度：37℃，发酵60h结束。[0022] 实施例3
步骤1至步骤3同实施例1。[0023] 步骤4，将灭菌后的发酵罐接入600ml的初始发酵培养基，利用储气罐控制CO2 和空气的混合气（体积比为1:3 ）的通气量为3 vvm，搅拌转速为500 r/min，按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初糖为30g/L，当培养基糖耗完，使用碳源补料罐一次性添加糖，使糖浓度达到30g/L，全程使用氢氧化镁控制pH为6.5，发酵温度：37℃，发酵30小时结束。[0024] 实施例4
步骤1至步骤3同实施例1，其中碳源补料罐培养液为淀粉糖化液。[0025] 步骤4，将灭菌后的发酵罐接入600ml的初始发酵培养基，利用储气罐控制CO2 和空气的混合气（体积比为1:1 ）的通气量为2 vvm，搅拌转速为300 r/min，按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初糖为50g/L，当培养基糖耗完，使用碳源补料罐一次性添加糖，使糖浓度达到30g/L，全程使用碳酸钾和碳酸镁控制pH为6.5，发酵温度：37℃，发酵72小时结束。
[0026] 实施例5
步骤1至步骤3同实施例1，其中碳源补料罐培养液为糖蜜。[0027] 步骤4，将灭菌后的发酵罐接入600ml的初始发酵培养基，利用储气罐控制CO2 和空气的混合气（体积比：1:5 ）的通气量为2 vvm，搅拌转速为200 r/min，按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初糖为50g/L，当培养基糖耗完，使用碳源补料罐一次性添加糖，使糖浓度达到30g/L，全程使用氢氧化钾控制pH为6.5，发酵温度：37℃，发酵30小时结束。[0028] 实施例6
步骤1至步骤3同实施例1，其中碳源补料罐培养液为木质纤维素水解液。[0029] 步骤4，将灭菌后的发酵罐接入600ml的初始发酵培养基，利用储气罐控制CO2 和空气的混合气（体积比为1:5 ）的通气量为2 vvm，搅拌转速为300 r/min，按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初糖为50g/L，当培养基糖耗完，使用碳源补料罐一次性添加糖，使糖浓度达到30g/L，全程使用碳酸钠控制pH为6.8，发酵温度：37℃，发酵72小时结束。
5
CN 104531782 A[0030]
说 明 书
4/4页
将上述实施例的发酵物进行液相测定，所得产物如数据表1所示。[0031] 表1本发明实施例1-6发酵产率记录表
对比例1
利用储气罐控制空气的通气量为1 vvm，初糖浓度为50g/L，当培养基糖耗完，使用碳源补料罐一次性添加糖，使糖浓度达到30g/L，全程使用碳酸钠控制pH为6.5，发酵温度：37℃，发酵72h结束。比较不同搅拌速度对发酵的影响，结果如表2所示。[0032] 表2为 不同转速对发酵产率的影响
对比例2
以目前文献报道发酵法生产丙酮酸，以基因工程菌Torulopsis glabrata 为出发菌株，采用批次发酵的方式，初始葡萄糖浓度为100g/L； 以基因工程菌Corynebacterium glutamicum 为出发菌株，采用批次发酵的方式生产丙酮酸，发酵结果如表3所示。[0033] 表3 不同发酵生产菌发酵产率记录表
通过实施例1-6可知，本发明利用产琥珀酸放线杆菌来生产丙酮酸效果较好，丙酮酸产率较高。通过对比例1可以看出，不同的搅拌转速对菌体产丙酮酸影响很大，当转速从100rpm升到300rpm，丙酮酸产率 (mmol g(DCW)-1 h-1)从0.6升到3.8，再升到400rpm后，产率降低到2.3，可以看出在特定的微氧条件下才能大量积累丙酮酸。通过对比例2，对比实施例1-6和对比例1可以明显看出，本方法丙酮酸的产率明显高于对比例2中的生产菌。综上所述，本发明所采用的方法，具有产率高，稳定性好，操作条件简单，适合工业化操作。为丙酮酸的工业化生产提供了一种高效经济的方法。
6
