清热化痰法对气道黏液高分泌大鼠气道炎症影响机制-杨峰,敖素华

JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM

辽宁中医药大学学报

Vol. 16 No. 5 May，2014

DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2014.05.008

清热化痰法对气道黏液高分泌大鼠气道炎症影响机制杨峰，敖素华

（泸州医学院附属中医医院，四川 泸州 6000）

目的：研究清热化痰法对气道黏液高分泌大鼠气道炎症的影响及机制。方法：将48只SD大鼠随机分摘 要：

为6组，每组8只，分别为空白组、模型组、低剂量止咳颗粒组、中剂量止咳颗粒组、高剂量止咳颗粒组、对照组，采取BALF细胞计数及分类观察炎症细胞、HE染色观察肺组织病理变化及ELISA检测血清NE等方法。结果：①细胞计数及分类：空白组、中、高剂量止咳颗粒组中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞较模型组、低剂量止咳颗粒组低（P<0.05或P<0.01）。②HE染色：正常大鼠气道黏液较少；模型组大鼠炎性细胞浸润及分泌物阻塞气道，肺泡壁多处断裂，部分肺泡融合成肺大泡；低剂量止咳颗粒组较模型组无明显变化；中剂量止咳颗粒组气管、支气管炎症细胞浸润减少；高剂量止咳颗粒组支气管管壁分泌物堵塞少，上皮细胞排列尚整齐；对照组肺泡壁断少，偶可见少许炎细胞。③血清NE：空白组、高剂量止咳颗粒组血清NE含量较模型组、低、中剂量组止咳颗粒组低（P<0.01）。结论：杏杷止咳颗粒能够通过清热化痰法减轻气道黏液高分泌大鼠气道炎症，其机制可能与血NE下降有关。

关键词：清热化痰法；气道；黏液高分泌；大鼠；炎症

(2014) 05- 中图分类号：R56 文献标志码：A 文章编号：1673-842X 0021- 04

Clearing Heat and Resolving Phlegm Method of Airway Inflammation in Rats with Airway Mucus SecretionYANG Feng，AO Suhua（Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine of Luzhou Medical School，Luzhou 6000，Sichuan，China）Abstract：Objective：To study the clearing heat and resolving phlegm method on airway inflammation of 麸杨及青麸杨叶上的虫瘿，有较强的抗菌活性及收[2]敛、止血功能；黄柏（Phellodendron amurense Rupr）为芸香科植物，以干树皮入药[3]；木香为菊科植物。它们都具有收敛、敛疮、抗菌、消炎、免疫调节等多种功能。机体的免疫系统直接影响着疾病的发生、发展及转归。因此，该制剂药用机制与其免疫调节功能密切相关。机体的免疫由特异性免疫和非特异性免疫组成。脾脏为体内重要的免疫器官，参与体液免疫和细胞免疫。而T、B淋巴细胞是反映机体特异性免疫功能的最重要的标志，脾脏指数的改变及其组织Fas表达水平可反映机体的免疫状况[4]。在Fas/FasL系统中Fas 功能为受体功能，当其与天然配体FasL 结合即发出凋亡信号，激发细胞内一系列反应，最终导致自身凋亡[5]。活化的淋巴细胞表面有Fas和FasL的表达，Fas介导细胞凋亡是维持免疫系统自稳态的重要调节过程[6]。脾作为体内最大的淋巴器官，绝大部分细胞成分是T、B 淋巴细胞（以T 细胞为主），并通过淋巴细胞再循环与其他淋巴器官、淋巴组织和血液不断进行着淋巴细胞交换。已有研究证明Fas 在活化的T、B淋巴细胞、NK细胞及单核细胞等免疫细胞里广泛地表达，近年来有研究发现Fas和干扰素等是与淋巴器官NK细胞的杀伤活性密切相关，是检测其活性的重要指标[7]。本实验结果显示，复方儿茶止泻霜能使免疫低下小鼠脾脏指数增加，即小鼠脾脏重量增加，从而增强机体免疫能力；同时使免疫功能抑制的小鼠脾脏淋巴细胞Fas蛋白表达增强，从而提高小鼠的免疫调节能力。综上所述，该制剂可通过对机体免疫功能的正向调节，改善机体的免疫抑制状态，使机体免疫能力增强。这可能是该制剂止泻、抗菌、消炎、收敛等功能的药用机理之一。通过更深入的研究，其作用机制将得到进一步的阐明。◆参考资料[ 1 ] 李杏翠，王洪庆，刘超，等.儿茶化学成分研究[ J ] .中国中药)( 杂志，2010，35 11 ：1425-1427.[ 2 ] 郑兰娟，罗艳萍，汪玉娇，等. 五倍子抗菌抗炎作用研究进展 [ J ] .中国病原生物学杂志，2011，6 ( 11 )：868-870.[ 3 ] 吴铁松，谢展雄，吴建伟，等. 黄连、黄柏对耐万古霉素肠球菌抑菌活性的研究[ J ] .赣南医学院学报，2010，30 ( 3 )：344-346.[ 4 ] 施宁川，姚立. 中药对Fas / FasL 细胞凋亡系统的作用[ J ] . 海峡药学，2010，22 ( 5 )：41-44.[ 5 ] 陆茜李，宁丽.Fas 介导细胞凋亡及相关免疫调节作用[ J ] .细胞生物学杂志，2006，4 ( 28 )：543-546.[ 6 ] Scholz M，Cinafl J. Fas/FasL interaction：a novelimmune therapy approach with immobilized biologicals[ J ] .Med Res Rev，2005，25 ( 2 )：331-342.[ 7 ] Nomura J，Matsumoto K，Iguchi·Ariga SM，et al. Mitochondfia·independent induction of Fas mediatedapoptosis by MSSP[ J ] .Oncol Rep，2005，14 ( 7 )：1305-1309．收稿日期：2013-10-29

基金项目：泸州市科技局课题（泸市科[2010]128号）作者简介：杨峰（1986-），男，图木舒克人，医师，硕士，研究方向：中西医治疗呼吸系统疾病。通讯作者：敖素华（1972-），女，重都人，教授、主任医师，博士，研究方向：中西医治疗呼吸系统疾病。

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rats with high airway mucus secretion and its mechanism. Methods：48 SD rats were randomly divided into 6 groups：the blank group，model group，low dose，middle dose and high dose of cough particle groups and the control group，8 in each group. The BALF cell count and classification were used to observe the inflammatory cells and HE dyeing for the observation of lung tissue pathology. ELISA method was used to detect serum NE，etc. Results：（1）Cell count and classification：In blank group and middle and high dose of cough particles groups， neutrophils，eosinophils and lymphocyte were lower than those of the model group（P<0.05 or P<0.01）.（2）HE stain：There was less airway mucus in normal rats. Model group rats blocked airway inflammatory cells infiltration and secretion with large area of alveolar walls fracture and part of the alveolar fusion into pulmonary bullae. Low doses of cough particles group compared with model group，there was no obvious change. Middel cough particle group's tracheal and bronchial inflammation cells infiltrations were reduced. High dose cough particles group's bronchial wall secretion was less and the epithelial cell arrangement was neat. Control group's alveolar walls were broken a little，even some visible inflammation cells.（3）Serum NE：blank group and high dose of cough particles group's NE level were lower compared with those of the model group and low dose of cough particles group（P<0.01）. Conclusion：Cough particles can reduce high airway mucus secretion and the mechanism may be associated with reducing blood NE.Key words：clearing heat and resolving phlegm method；airway；high mucus secretion；rat；inflammation气道黏液高分泌是慢性气道炎性疾病（COPD、支气管哮喘、肺囊性纤维化等）的重要病理特征[1]，大量黏液潴留气道，导致气道反复感染和病情加重。感染又可引起大量炎性细胞浸润及炎症介质释放，并导致气道上皮杯状细胞增生肥大，杯状细胞增生又引起黏蛋白高表达，从而导致气道黏液高分泌。炎症情况下，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）被迅速释放，强烈刺激黏液分泌及中性粒细胞（PMN）的浸润。PMN激活后又进一步释放NE，形成恶性循环，促进气道黏液高分泌。慢性气道炎性疾病气道黏液高分泌临床大多数可见咳嗽、咯黄黏痰、舌红苔黄等表现，属于中医痰热郁肺证。杏杷止咳颗粒清热化痰止咳，通过对大鼠气道黏液高分泌模型的临床疗效观察，初步探讨清热化痰法对气道黏液高分泌气道炎症的影响及机制。1 材料和方法1.1 实验动物雄性SD大鼠48只，体重250~280 g，8~10周龄，由泸州医学院动物实验中心提供，生产条件许可证（一级标准）：川医动管24101115号。1.2 实验药物及试剂杏杷止咳颗粒（颗粒剂10 g/袋，每克相当于原生药3 g）（由泸州医学院附属中医院制剂室提供）；丙烯醛（江苏昆山市化学试剂厂生产）；大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）ELISA试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）。1.3 实验方法予等量生理盐水灌胃，1次/d。 1.3.2 标本采集及处理 治疗12 d后，用硫喷妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，离心后储存血清在-20 ℃的冰箱内备做血清NE ELISA试验。随后暴露双肺，止血钳夹闭右肺门取下右肺，将右中肺置于4%多聚甲醛缓冲液中固定，按照常规程序最终制成5 μm厚的石蜡切片；左肺保留于体内待制备肺泡灌洗液。1.3.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集及细胞分类计数 快速留取右肺组织标本后，迅速于气管下段做一T形切口，插入内径约1 mm的塑料管至左肺，丝线固定，用注射器注入2 mL Hank's液，见左肺充分膨胀，保留1 min后缓慢回抽。如此反复进行3次，共注入Hank's液6 mL，BALF回收率约90％。BALF混匀后用血球计数板按公式（每毫升原悬液细胞数=4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数）计细胞总数。离心后细胞沉渣涂片，行瑞氏染色，在油镜下计数200个细胞，进行细胞分类计数。细胞分类判定标准：根据细胞形态学特征分类计数中性粒细胞紫红色、淋巴细胞蔚蓝色和嗜酸性粒细胞桔红色[3]。1.3.4 苏木精-伊红染色（HE染色） 石蜡切片脱腊至水→苏木精染色5 min→脱水10 min→1％盐酸乙醇分化10 s→中性树胶封片→光学显微镜下观察。1.3.5 大鼠血清NE检测 采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清NE水平，实验步骤按试剂盒说明书进行。1.4 统计方法1.3.1 气道黏液高分泌大鼠的模型复制 48只大鼠随机分为6组，每组8只。分别为空白组（A组）、模型组（B组）、低剂量止咳颗粒组（4.4 g生药/kg，C组）、中剂量止咳颗粒组（8.8 g生药/kg，D组）、高剂量止咳颗粒组（17.5 g生药/kg，E组）和对照组（氨[2]溴索片40 mg/kg，F组）。按Borchers等方法制作大鼠气道黏液高分泌模型：B组、C组、D组、E组、F组大鼠于自制染毒箱中用丙烯醛液雾化，6 h/d，每周5 d，第12天时结束，A组雾化吸入等量生理盐水。C组、D组、E组、F组在丙烯醛液雾化前1 d开始分别以相应药物灌胃，1次/d，持续12 d，A组和B组仅给实验结果采用SPSS19.0统计学软件处理，各指标采用均数±标准差表示，各组之间比较使用方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义，P>0.05表示差异无统计学意义。2 结 果2.1 BALF中细胞计数及分类结果中、高剂量止咳颗粒组细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞较模型组降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），说明中、高剂量止咳颗粒能通过清热化痰法抑制气道黏液高分泌中性粒细胞、嗜酸22

16卷                                  辽宁中医药大学学报              性粒细胞、淋巴细胞浸润。见表1。表1 各组大鼠BALF中细胞总数及分类比较（—x±s） 组别 n 细胞总数（×105/mL） 嗜酸性粒细胞（%） 中性粒细胞（%） 淋巴细胞（%）A组 8 28.25±5.55 ★ 4.67±0.78 ★ 7.37±2.62★ 14.05±1.79★B组 5 83.00±5.92 △ 12.50±2.03△ 16.86±1.25 △ 20.30±2.28△C组 8 80.50±3.△ 10.20±3.45△ 15.85±2.13△ 19.14±3.30⊙D组 7 58.86±4.85△★ 7.75±2.60★ 12.19±3.05⊙▲ 16.38±2.60E组 7 32.71±5.74★ 5.59±0.67★ 9.33±1.90★ 15.23±2.10▲F组 7 56.86±3.85★ 5.73±1.07★ 9.40±2.32★ 15.44±1.98▲注：与模型组比较，★P<0.01，▲P<0.05；与对照组比较，△P<0.01，⊙P<0.05。2.2 大鼠肺组织病理HE染色结果正常大鼠气道可见少许黏液（见图1）；模型组大鼠支气管上皮黏膜下腺体肥大、增生，炎性细胞浸润及分泌物阻塞；肺泡壁多处断裂，部分肺泡融合成肺大泡（见图2）；低剂量止咳颗粒组肺泡壁断裂多，肺泡腔扩大（见图3）；中剂量止咳颗粒组可见气管、支气管炎症细胞浸润减少（见图4）；高剂量止咳颗粒组支气管管壁无增厚，管腔无狭窄，无分泌物堵塞，上皮细胞排列尚整齐（见图5）；对照组肺泡壁断少，偶可见少许炎细胞（见图6）。肺泡壁完整图1 A组HE染色（×100）大量炎性细胞浸润，肺泡腔扩大，肺泡壁断裂图2 B组HE染色（×100）肺泡壁断裂，肺泡腔扩大图3 C组HE染色（×100）炎性细胞减少，肺扩大泡壁稍完整图4 D组HE染色（×100）炎性细胞少，上皮细胞排列尚整齐图5 E组HE染色（×100）炎性细胞、肺泡壁断裂少图6 F组HE染色（×100）2.3 血NE ELISA结果中、高剂量止咳颗粒组血清NE较模型组下降，差异具有明显统计学意义（P<0.01）。见表2。表2 各组血清NE含量（—x±s） 组别 n 各组血清NE含量（%）A组 8 45.52±3.90★B组 5 77.58±2.94△C组 8 75.12±2.85△D组 7 .62±4.16★△E组 7 47.11±3.71★F组 7 48.76±2.90★注：与模型组比较，★P<0.01；与对照组比较，△P<0.01。3 讨 论3.1 气道炎症与气道黏液高分泌慢性气道炎性疾病主要病理改变有气道炎症反应和气道黏液高分泌。正常情况下，气道表面分泌少量黏液，是人体呼吸道一道重要防御屏障。当气道存在慢性炎症时，在烟雾、感染、变应原等有害因素的刺激下，导致气道上皮受损和炎症细胞浸润，并释放各种炎性介质，通过介导细胞内信号转导途径促进黏液细胞分泌亢进，使黏液大量分泌并反复23

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阻塞气道，过度分泌的黏液造成细菌定植，其病理产物又促进气道黏液高分泌[1]。气道黏液是由气道上皮杯状细胞和黏膜下腺分泌，其高分泌的基础是气道主要黏蛋白muc5ac的产生增加。目前认为，气道黏液高分泌已成为影响慢性气道炎性疾病预后的危险因素。通过有关分析显示[4]气道炎症与气道黏液高分泌有明显的关联性，即肺组织的炎症反应是气道黏液高分泌的重要致病因素。长期的气道炎症、损伤修复可引起气道重塑，最终导致气道的气流受限不可逆。众所周知，许多炎性细胞、炎性介质和细胞因子参与气道黏液高分泌的调节和分泌。中性粒细胞是COPD、肺囊性纤维化及支气管哮喘急性发作期的主要炎症细胞。大量炎性介质[5]如IL-6、IL-8、IL-12、TNF-a、IL-1β、巨噬细胞炎症蛋白-2、IFN、补体等将中性粒细胞从肺血管募集至气道和肺泡腔活化。活化的中性粒细胞又释放大量细胞因子及NE等，出现呼吸爆发，引起气管、支气管及其周围组织炎性细胞的侵袭，气道上皮损伤脱落，气道及肺泡腔内炎性渗出，杯状细胞增生肥大，表现以中性粒细胞浸润为特征的肺炎症反应及气道黏液高分泌。Bhowmik[6]的研究还显示COPD病人第1 s呼气容积（FEV1％）与BALF中的PMN数呈负相关。本实验采用香烟中主要成分丙烯醛雾化造模大鼠，12 d后发现BALF中模型组嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血清NE含量较空白组高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；模型组大鼠右肺中叶行HE染色发现支气管管腔及管壁大量炎性细胞浸润，并充血、水肿，黏液阻塞管腔，支气管黏膜上皮细胞变性坏死，纤毛倒伏、粘连、变短，部分脱落，腺体增生肥大，基底膜增厚，证明模型复制成功。3.2 清热化痰法对气道黏液高分泌的影响气道黏液高分泌疾病属于祖国医学“肺胀”“咳嗽”“哮证”等范畴，病机为本虚标实，临床主要表现为咳嗽、咯黄黏痰、胸闷、气喘、脉数、苔黄腻等痰热郁肺证。肺主气司呼吸，主通调水道，外邪犯肺，导致肺失宣降，上逆为咳，升降失常则为喘。咳喘日久出现子盗母气而致脾气虚，脾虚运化水湿失职，则易形成痰饮，痰湿上犯，则肺失肃降而致咳嗽、痰多、气喘。久病及肾，肾不纳气，疾病反复发作；肾阳虚则不能温化水湿、湿聚生痰，痰湿郁而生热而致痰热郁肺。我院院内制剂杏杷止咳颗粒（桑白皮15 g，黄芩15 g，枇杷叶15 g，浙贝母10 g，板蓝根15 g，鱼腥草20 g，杏仁10 g，茯苓10 g，甘草6 g）君药为桑白皮、黄芩，二者合用共奏清热化痰、泻肺平喘之功；浙贝母、枇杷叶清热化痰；鱼腥草、板蓝根清热解毒；杏仁降气止咳平喘；方中佐以茯苓健脾渗湿，甘草补脾益气，以截断“生痰之源”，袪邪不伤正，补虚不碍袪邪。本实验发现中、高剂量杏杷止咳颗粒组细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞较模型组降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；中、高剂量止咳颗粒组血清NE较模型组下降，差异具有明显统计学意义24

（P<0.01）；右肺中叶行HE染色发现：低剂量杏杷止咳颗粒组较模型组无明显变化；中剂量杏杷止咳颗粒组可见气管、支气管炎症细胞浸润减少；高剂量杏杷止咳颗粒组、对照组支气管管壁无增厚，管腔无狭窄，无分泌物堵塞，偶可见少许炎细胞。因此，中、高剂量杏杷止咳颗粒可以通过清热化痰法控制气道炎症而减轻气道黏液高分泌。3.3 清热化痰法治疗气道黏液高分泌的机制有西医学者认为[7]控制炎症可能是一种治疗黏液高分泌的方法，但又有专家持相反意见，认为通常能减轻炎症的激素药物对多数临床COPD患者的治疗无效，而许多重症的哮喘患者气道黏液高分泌对激素耐药。中医药具有多靶点防治疾病的特点，在治疗气道黏液高分泌方面也有一定优势。研究发现，杏杷止咳颗粒具有止咳、化痰、抗炎、平喘功效，并能降低慢支炎大鼠TNF-α和IL-8水平[8]。李文等[9]在研究中发现在西医基础治疗上加用清热化痰制剂痰热清注射液能够较好地改善AECOPD痰热阻肺证患者中医症状及体征，其机制可能是通过促进IL-8、NE水平的下降以及延缓IL-10水平下降而改善气道炎症及气道黏液高分泌。药理研究证明[10]，清热化痰方药除了能抗感染以外，还有解热消炎、抗内毒素、提高巨噬细胞功能的作用。本实验发现中、高剂量止咳颗粒可减轻气道炎症，同时降低血清NE，不难推测，止咳颗粒治疗气道黏液高分泌可能机制是通过减少最强促黏液分泌剂NE的释放而控制气道炎症，其机制有待进一步研究。综上所述，清热化痰方杏杷止咳颗粒不仅能标本兼顾，缓解症状，截断生痰之源，且性价比高，有可能成为气道黏液高分泌治疗的理想药物。◆参考文献[ 1 ] 丁艳苓，姚婉贞.慢性阻塞性肺疾病与哮喘气道炎症的研究[ J ] . 中国呼吸与危重监护杂志，2004，6 ( 3 )：410-412.[ 2 ] Borchers MT，Wert SE，Lei kauf GD.Acrolein-induced Muc5ac expression in rat airways[ J ] .Am J Physiol，1998，274 ( 4 )：1573-1581.[ 3 ] 汪隽瑛，方凤，刘枫，等.盐酸氨溴索对慢性哮喘大鼠气道炎症及杯状细胞增生的影响[ J ] .第四军医大学学报，2003，24 ( 16 )：1472-1475．[ 4 ] 欧雪梅.大环内酯类抗生素对气道粘液高分泌过程的作用及分子机制研究[ D ] .成都：四川大学，2006：38-42.[ 5 ] Fujihara M，Muroi M，Tanamoto K，et al. Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by LPS：roles of the receptor complex[ J ]．Pharmaeol Ther，2003，100 ( 2 )：171-194.[ 6 ] Bhowmik A，Seemungal TA，Sapsford RJ，et al. Relation of sputum inflammatory markers to symptoms and lung function changes in COPD exacerbation[ J ] .Thorax，2000，55 ( 2 )：114-120.[ 7 ] 欧雪梅，冯玉麟，文富强，等.大环内酯类抗生素对气道粘液高分泌过程的作用及其机制研究[ J ] .中国呼吸与危重监护杂志，2006，5 ( 2 )：140-145.[ 8 ] 彭素岚，敖素华，王俊峰，等.止咳颗粒治疗慢性支气管炎的动物实验研究[ J ] .西部医学，2010，22 ( 6 )：998-1000.[ 9 ] 李文，毛兵，，等.从气道炎症和气道粘液高分泌研究清热化痰法治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰热阻肺证的机制[ J ] .中西医结合学报，2008，6 ( 8 )：799-805.[ 10 ] 史锁芳.慢阻肺祛痰八法述要[ J ] .国医论坛，1999，14 ( 14 )：14-16.（MIP-2）