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国际口腔医学杂志第３４卷第２期２００７年３月 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇ３￣Ｖｏ１．３４ Ｎｏ．２ Ｍａｒｃｈ，２００７ 现代分子技术在口腔微生物生态学研究中的应用 褚敏综述梁景平审校 （上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔内科 上海２０００１ １） 【摘要】 细菌感染是口腔疾病的主要病因之一，而现代分子技术作为新的研究方法能更深入、更 全面了解口腔微生物的特性及其在口腔感染性疾病中的作用。本文就近年来常用于口腔微生物 生态学研究的一些分子技术的原理、用途及优、缺点作一综述。 【关键词】现代分子技术； 口腔微生物； 生态学 【中图分类号】Ｑ９３８．１ 【文献标识码】Ａ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ ＣＨＵ Ｍｉｎ，ＬＩＡＮＧ胁ｇ－ｐｉｎｇ． （Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｉｎｔｈ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｐｅｏｐｌｅ Ｈｏｓｐｉｔｌａ，Ｓｈ，￣ａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ ｅ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００１１，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｂａｃｔｅｒｉａ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｔｏ ｐｌａｙ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｔｉｏｌｏ￣ｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍｅ ｏｒｌａ ｄｉｓ－ ｅａｓｅｓ．Ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｈａｖｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｔｈｅ ｄａｔａ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｏｒａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｎｄ ｔａｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｔｏ ｒｅｖｉｅｗ ｔｈｅ ｆｕｎｄａｍｅｎｔｌ ｐｒａｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｌ ｅｃｏｌａｏｇｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａ— ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｒ ｔａｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｒｅ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ， ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｍｏｌｅｃｕｌｒ ａｐｐｒｏａｃｈ；ｏｒａａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ；ｅｃｏｌｏｇｙ 长期以来，纯培养技术是研究微生物的主要 手段，然而，它也严重了认识了解微生物的 视野。据估计，环境中只有约５％的微生物能够 被分离和纯化，而口腔中可培养的细菌也只占 ５０％，因此，用传统的微生物培养和鉴定方法不 客观合理的细菌分类，最具代表性的例子表现在 根管感染细菌的研究方面。 Ｃｏｎｒａｄｓ等【 】最早用１６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析检测根 管内细菌，并首次在感染根管内检测到福赛斯类 杆菌。随后，其他学者在研究感染根管及根管治 足以代表微环境中的真实情况。近年来，现代分 子技术的成熟，为微生物生态学研究提供了新的 方法，也促进了口腔微生物学研究的进一步发展。 为此，本文将近年来常用于口腔微生物生态学研 究的一些分子技术分类综述如下。 １口腔微生物鉴定 疗失败的根管内的病原菌时常使用此技术。结果 证实，采用１６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析检测根管细菌 时，其检出率远远高于传统的培养技术，甚至可 １００％检测出根管内的细菌【习。 １６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析虽然是最常用的检测病原 微生物的方法，能快速、准确地检测口腔微生物， 但费时且价格昂贵，故难以大规模应用。 １．２实时聚合酶链反应 传统的ＰＣＲ都只能进行定性或半定量分析， 唯一例外的是实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ），又称荧 光定量ＰＣＲ。该技术在常规ＰＣＲ基础上运用荧光 １．１ １６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析 １６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析即克隆测序技术，是利用 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因两端的保守序列作为聚合酶链反应 （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣ 引物，通过ＰＣＲ 扩增染色体ＤＮＡ上的ｌ６Ｓ ｒＲＮＡ基因进行序列分 能量传递技术，加入荧光标记探针，把核酸扩增、 杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借 助于荧光信号来检测ＰＣＲ产物。目前该技术已被 应用于病原体测定、免疫分析、肿瘤基因测定、 析，获得系统发育学信息。此法可以快速、准确 地鉴定口腔细菌，并依据系统发育学信息进行更 【收稿日期】２００６—０４—３０； 【修回日期】２００６－０８—１６ 【作者简介】褚敏（１９７３一），女，上海人，主治医师，硕士 基因表达、基因突变和基因多态性研究等方面。 在口腔微生物学研究中，实时ＰＣＲ的应用仍集中 【通讯作者】粱景平，Ｔｅｌ：０２１－－６３１３５２１４ 维普资讯 http://www.cqvip.com
·８２· 于病原菌测定。 在牙周方而，Ｌｙｏｎｓ等 首先用ＴａｑＭａｎ系统成 功地确定了龈下菌斑内的总菌量和牙龈卟啉菌数 量。随后，其他学者的定量实验进一步证实：牙 周炎忠者牙周病原菌的平均量大于正常个体。此 后，实时ＰＣＲ又被证实能定量检测变形链球菌和 表兄链球菌的数量，从而有助于定量分析『＿ｌ腔龋 病标本中的微生物和生物膜构成 。而ＳｅｄｇＩｅｙ等Ｉ５１ 在根管再感染病例的研究中发现，实时ＰＣＲ法对 根管内粪肠球菌的检出率高于培养法。 ２ 口腔微生物群落的遗传多样性分析 口腔中约有１ １个菌属的７００个菌种或基冈型 的细菌，理沦上都可能是潜在的病原菌，仅依靠 １６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析了解不同时问和空间内的微生 物组成，进而确定病原菌，但此方法无疑费时且 昂贵，而分子杂交及以ＰＣＲ为基础的核酸指纹图 谱技术的应用，更有利于快速评估微生物多样性 及不同环境中的微生物群落变化。 ２．１棋盘式ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交技术 １９９４年，Ｓｏｃｒａｎｓｋｙ等［６１首先报道了棋盘式 ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交技术可利用单张膜上的大量ＤＮＡ 探针同时检测１个或多个样本中的大量细菌，是 种快速、敏感、相对便宜的微生物学检测技术。 有学者在研究龈下菌斑中的革兰阴性菌群时最早 使用棋盘式ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交技术，此技术能同时 定量分析菌斑样本中的４Ｏ种细菌 。此后，该技 术在牙周病致病菌的研究中得到广泛应用，成为 有效检测复杂微生物系统中的细菌种类和评估牙 周治疗效果的重要方法之一。近年来，通过技术 修正，该方法开始用于革兰阳性致龋菌的分析研 究阎。牙髓病学研究中，Ｓｕｎｄｅ等嘲用该技术成功检 测到根尖周损害中的细菌；而在治疗方面， Ｄｅ— Ｓｏｕｚａ等㈣运用该技术证实，常规根管治疗加氢氧 化钙虽然能减少导致牙髓坏死的病原菌，但是不 能清除所有微生物。 应用棋盘式ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交技术检测微生物 标本的缺点在于，由于ＤＮＡ探针的制备总是来源 于可培养细菌的，因此，该技术也只能用于检测 可培养细菌；再者，不同菌种问存在同源序列， 因此，一旦与非检测细菌产生交叉反应，则会产 生假阳性结果。 ２．２荧光原位杂交 荧光原位杂交（ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａ一 国际口腔医学杂志第３４卷第２期２００７年３月 ｌ！！ｔｅｍａｔｉ９ｎａＩ Ｊ９ｕｍａｔｏｆ ＳｔｏｍａｔｏＩｏ ． ： 墅 ２Ｑ ｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）始于２０【廿纪８０年代末，是通过荧光标 记的探针杂交完整绌胞内的特异性互补靶序列检 测核苷酸序列，不仅可以检测可培养微生物，也 能检测那些尚不能培养的微生物，还能提供有关 微生物存在与否、数量、形态构成以及空间分布 等方面的信息。 Ｇｅｒｓｄｏｒｆ￣ｔ“】尝试用ＦＩＳＨ检测牙周炎患者龈下 菌斑中的革兰阴性厌氧菌后认为，ＦＩＳＨ是研究牙 周微生物生态学的有用方法。ＦＩＳＨ结合激光共 聚焦扫描电镜（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ＣＬＳＭ）可以分析牙周炎患者的龈下菌斑结构特点 和优势病原菌。此外，该技术还可以用于不可培 养的ＴＭ７细菌的研究［１２ｊ。龋病学方面，Ｂａｎｅｒｊｅｅ 等『ｒｊ】使用ＦＩＳＨ检测了龋病患者牙本质内的总菌群 后，认为ＦＩＳＨ有助于进一步确定龋坏牙本质内 全部细菌的分布、丰度和生存能力，更好地理解 龋病的病理过程。在根管细菌的研究中采用ＦＩＳＨ 和ＣＬＳＭ，能直接观察和鉴定根尖周损害中的微 生物【 。 ２＿３变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳技术 变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）和温度梯度凝胶电泳 （ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＴＧＧＥ） 技术是基于１６Ｓ ｒＲＮＡ高变区的碱基序列不同来 分辨不同的微生物群落。近年来，该技术已广泛 应用于微生物群落多样性、复杂微生物群落结构 演替规律、微生物种群动态性、重要基因定位、 表达及的评价分析；而用于口腔龈下菌斑和 根管内微生物群落方面的研究则刚刚起步。 ＦｕｊｉｎＩｏｔｏ等［１５１于２００３年应用ＤＧＧＥ技术分析 了龈下菌斑的微生物群落，结果发现，ＤＧＧＥ技 术虽然在敏感性上略逊色于原有的ＰＣＲ方法，但 还是能有效地显示菌斑中的细菌组成，揭示菌斑 的主要菌种。同期，Ｚｉｊｒｌｇｅ等【１６】分析了９名牙周炎 患者治疗前后３个月的牙周袋内菌群动态变化情 况，发现治疗后３个月的菌群中，有３３％～４７％的 微生物组成不同于治疗前。在根管微生物学的研 究方面，学者们【１７－１８１证实，根管内菌群因牙而异， 慢性根尖周炎和急性根尖周脓肿的根管内微生物 组成明显不同，而粪肠球菌虽然在根管治疗失败 的根管内检出率很高，但在图谱中并非表现为优 势菌。最近，Ｌｉ等㈣将ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术用于龋病 易感性研究，通过图谱分析无龋和高龋个体的唾 液标本中可培养细菌的组成，结果发现，无龋个 维普资讯 http://www.cqvip.com
国际口腔医学杂志第３４卷第２期２００７年３月 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ Ｌ』Ｑ蜓 ９＿ｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ３４ Ｎｏ：２ Ｍ￣ｊ ｅ！ 体的口腔微生物多样性明显高于高龋组，提示高 龋个体的口腔微生物群落中可能缺少部分细菌， 或部分细菌受到抑制或取代。 尽管ＤＧＧＥ和ＴＧＧＥ技术能够再现微生物群 落多样性，获得微生物在时问和空问上的动态信 息，但在技术应用方丽仍有局限性，如：ＤＧＧＥ 法不能对样品中所有的ＤＮＡ片段进行分离，只 能对微生物群落中数量上大于１％的优势种群进 行分析：而且不同的实验条件很可能导致不同的 带型图谱，无疑会影响分析结果。 ２ｒ４末端性片段长度多态性分析技术 末端性片段长度多态性（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃ— ｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，Ｔ—ＲＦＬＰ）分析 技术又称１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的末端性片段（ｔｅｒ— ｍｉｅｒｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ＴＲＦ）分析技术。此技 术是通过分析酶切ＰＣＲ产物形成的不同长度的末 端性片段来研究微生物群落组成情况，应用 范围包括：菌种鉴定、微生物群落对比分析、群 落中种群多样性评估等领域。近年也成功用于口 腔微生物群落的分析研究。 Ｒｏｌｐｈ等 比较了，培养法和Ｔ—ＲＦＬＰ技术的根 管内细菌检出率的差别。结果证实，Ｔ—ＲＦＬＰ技 术不仅检出率高于培养法，而且检测到的菌群更 具多样性，还能检测到先前未鉴定或未能培养的 细菌。不仅如此，Ｔ—ＲＦＬＰ的研究结果还发现： 根充后的根管内同样存在多种细菌，这一结论与 传统培养技术报道的结果相悖。 日本学者Ｓａｋａｍｏｔｏ等【２１Ｊ则将Ｔ—ＲＦＬＰ技术用于 牙周病患者的菌群分析。结果证实，Ｔ—ＲＦＬＰ分 析可以有效地评估口腔菌群的多样性，快速比较 牙周炎患者和无牙周炎个体的菌群结构，也能用 于评价牙周炎的疗效。 Ｔ—ＲＦＬＰ技术因快速、高灵敏度和能输出定 量的数据等优点使之成为研究微生物群落特征的 理想方法之一。不过由于设备昂贵，难以推广使 用。同时此技术结果的可靠性易受到引物和 性内切酶等因素的影响。 ３结束语 现代分子技术在口腔微生物学研究中的应 用，可以更深入、全面了解口腔微生物的特性和 口腔感染性疾病的发病机理，而技术方面的不断 ·８３· 改进也必将对口腔疾病的诊断和防治产生重要影 ｌ向。 ４参考文献 ｆ ｌ Ｊ Ｃｏｒｔｒａｄｓ Ｇ，Ｇｈａｒｂｉａ ＳＥ，Ｇｕｌａｂｉｖａｌａ Ｋ．ｅｔ ａ１．Ｊ Ｅｎｄｏｄ． １９９７，２３（７）：４３３—４３８． 【２］ Ｓｉｑｕｅｉｒａ Ｊ ，Ｒｏｃａｓ ＩＮ．Ｏｒａｌ Ｓｍｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａ１．Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ．２００４．９７（１）：８５—９４． 【３］Ｌｙｏｎｓ ＳＲ，Ｇｆｉ￣ｎ ＡＬ，Ｌｅｙｓ ＥＪ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｅｍｂｉｏｌ，２０００， ３８（６）：２３６２—２３６５． ｆ４１ Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ。Ｓｕｚｕｋｉ Ｎ，Ｎａｋａｎｏ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｅｒｏｂｉ一 ０ｌ，２ｏｏ３。４ｌ（９）：４４３８—４４４１． ［５］ Ｓｅｄｇｌｅｙ ＣＭ，Ｎａｇｅｌ ＡＣ，Ｓｈｅｌｂｍ＇ｎｅ ＣＥ，ｅｔ ａ１．Ａｒｃｈ Ｏｒａ１． Ｂｉｏ１．２００５．５０（６）：５７５—５８３． ［６］ Ｓｏｃｒａｎｓｋｙ ＳＳ，Ｓｍｉｔｈ Ｃ、Ｍａｒｔｉｎ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｉｑｕｅｓ， ｌ９９４，ｌ７（４）：７８８—７９２． ［７］ Ｓｏｅｒａｎｓｋｙ ＳＳ，Ｈａｆｌａｊｅｅ ＡＤ，Ｃｕｇｉｎｉ ＭＡ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ。ｌ９９８，２５（２）：ｌ３４—１４４． ［８］ Ｗａｌｌ—Ｍａｎｎｉｎｇ ＧＭ，Ｓｉｓｓｏｎｓ ＣＨ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＳＡ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２ｏｏ２．５ ｌ（３）：３０１—３ ｌ１． ［９］ Ｓｕｎｄｅ Ｉ Ｔｒｏｎｓｔａｄ Ｌ Ｅｒｉｂｅ ＥＲ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｄｏｄ Ｄｅｎｔ Ｔｒａｕ— ｍａｔｏ１．２０００．１６（５）：１９ｌ—ｌ９６． ｆｌ０］Ｄｅ－Ｓｏｕｚａ ＣＡ， Ｆｅｌｅｓ ＲＰ．Ｓｏｕｔｏ Ｒ ｅｔ ａＬ Ｊ Ｅｎｄｏａ，２００５、 ３ｌ（２）：７９—８３． ［１】］Ｇｅｒｓｄｏｒｆ ｔｔ，Ｐｅｌｚ Ｋ Ｇｏｂｅｌ ＵＢ．ＦＥＭＳ ｈｎｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉ— ｅｒｏｂｉｏｌ，ｌ９９３，６（２／３）：ｌＯ９一ｌ１ １． ［１２］Ｂｒｉｎｉｇ ＭＭ，Ｌｅｐｐ ＰＷ，Ｏｕｖｅｒｎｅｙ ＣＣ，ｅｔ ａ１．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉ－ ｒｏｎ Ｍｉｅｒｏｂｉｏ１．２００３．６９（３）：１６８７—１６９４． ［１３］Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｙａｓｓｅｒｉ Ｍ，Ｍｕｎｓｏｎ Ｍ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ，２００２， ３０（７／８）：３５９—３６３． ［１４］Ｓｎｎｄｅ ｅｒ，Ｏｌｓｅｎ Ｌ Ｇｏｂｅｌ ＵＢ，ｅｔ ａＬ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３， １４９（Ｐｔ５）：１ｏ９５一ｌ１Ｄ２． ｆ１５］Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｃ，Ｍａｅｄａ Ｈ，Ｋｏｋｅｇｕｅｈｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ，２００３．３８（４）：４４０—４４５． ｆ１６］Ｚｉｊｎｇｅ Ｖ，Ｈａｒｍｓｅｎ Ｈ３，Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄｅｒ ＪＷ，ｅｔ ａ１．Ｏｒａｌ Ｍｉ— ｅｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，１８（１）：５９—６５． 【１ ７］Ｓｉｑｕｅｉｒａ ＪＦ，Ｒｏｃａｓ １Ｎ，Ｒｏｓａｄｏ ＡＳ．Ｏｒａｌ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ Ｉｍ— ｍｕｎｏ｜，２ＯＯ４＇ｌ ９（６）：３６３—３７０． 【ｌ８］Ｉｓａｂｃｌａ Ｎ，Ｒｏｃａｓ ＩＮ，Ｓｉｑｕｅｉｒａ ＪＦ，ｅｔ ａ１．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ，２００４。９８（６）：７４１— ７４９． ［１９］“Ｙ， ｌ ＣＹＳ，Ｘｕ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ，２００５，８４（６）： ５５９—５６４． 【２ｏ］Ｒｏｌｐｈ ｔ－Ｉ３，Ｌｅｎｎｏｎ Ｒｉ髂ｉｏ ＭＰ，ｅｔ ａＬ Ｊ Ｃ［ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ［， ２ｏｏ１．３９（９）：３２８２—３２８９． ［２１］Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｍ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｙ，Ｕｍｅｄａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌ。２ｏｏ３，５２（Ｐｔ１）：７９—８９． （本文编辑张凌琳）
