犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因的克隆分析_易立

犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因的克隆分析

易 立,程世鹏,闫喜军,柴秀丽,罗国良,张海玲,王建科,赵建军

(中国农业科学院特产研究所,吉林吉林 132109)

*

摘要:2006年从南京疑似细小病毒感染的病犬中分离犬细小病毒一株,分离的病毒培养物能凝集猪红细胞,凝集效价达到128倍,并能被已知的

犬细小病毒阳性血清所抑制。其衣壳蛋白基因VP2被克隆并测序,核酸、氨基酸序列同源性分析表明:血清型为CPV-2b。通过软件对其氨基酸序列分析,预测VP2区域可能的B细胞表位分别为:5-30,定了基础。

300-320,

360-380,

380-400,400-420区段,这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠

关键词:犬细小病毒;分离;鉴定;克隆;序列分析

中图分类号:S8581292 文献标识码:B 文章编号:0529-5130(2008)04-0060-04

犬细小病毒病是一种引起犬的急性出血性肠炎或

急性心肌炎为主要表现的传染病。首先发现是在1978年的美国,随后该病迅速蔓延,导致全世界范围内的流行。自1983年,徐汉坤等报道犬细小病毒病在我国流行以来,该病对我国养犬业造成了极大的危害,已成为犬的一种重要传染病。病毒经过30年不断进化、变异,犬细小病毒的疫苗有时不能完全

收稿日期:2007-10-22

基金项目:科技部农业科技成果转化资金项目(05EFN216900361)。作者简介:易立(1982-),男,硕士。*通讯作者。

[1]

保护犬,免疫失败常有发生。所以,分离犬细小病毒目前的流行毒株以及对其结构蛋白VP2基因克隆和序列分析是了解和掌握犬细小病毒流行病学及其变异趋势的重要手段,有利于更加深入地研究犬细小病毒,并为开发新型的免疫、诊断制剂提供帮助。1 材料与方法

111 试验材料

病料:从南京某宠物医院临床表现有体温升高、呕吐、血样腹泻、脱水等症状的疑似犬细小病毒的病例中,采集粪样6份。

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试验动物:2只2月龄分窝未免疫幼犬,购自中国农业科学院特产研究所犬厂,观察饲养两周后,无

不良反应,供本试验使用。

细胞生长液、细胞维持液、细胞消化液等均按照文献[2]配制。

[9]

Michella等曾报道,用辛酸-硫酸铵法可获得与阴离子交换树脂法同样纯度的IgG,且收获率高(>80%),纯化后的IgG没有明显的功能上的损失。本试验用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化IgG,经SDS-PAGE鉴定IgG纯度较高。

本试验利用生理学法合成的结合抗原PEN-BSA,其免疫原性强于EDC法合成的结合抗原。PEN-BSA免疫动物后获得的多克隆抗体效价高、性质稳定,为建立免疫分析方法检测青霉素残留提供了合格的抗体试剂。参考文献:

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畜牧与兽医 2008年 第40卷 第4期#61#

工具酶及试剂:TaqDNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;各种性内切酶、均购自MBIFer-mentas公司;DNA回收试剂盒购自博日生物工程公司;新生牛血清(NCS)购自兰州民海生物有限公司,使用前经56e灭活30min;MEM购自GIBCOBRL公司;Tri碱购自Promega公司;2-巯基乙醇(2-ME)、DTT、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺和N,N.-亚甲基双丙烯酰胺购自Sigma公司;其他化学试剂均购自长春宝泰克生物公司。

引物设计:参照GenBank发表的犬细小病毒序列,设计VP2基因扩增引物。

引物1:5cATGAGTGATGGAGCAGTTCAA;引物2:5cCCGCTCGAGTTAATATAATTTTC。

112 试验方法

序列分析:应用生物软件DNASTAR610。2 结果

211 病毒分离结果

2号病料接种于CRFK细胞上,5d后可见特征病变:细胞圆缩、游离、脱落。继续传代5代后,细胞病变继续存在。用该培养物作血凝试验,其效价为26,并可被被CPV阳性血清所抑制。初步认为6号

病料中含有CPV,如图1、图2所示。

病料处理:将采集的病料用pH714的无菌PBS重悬,并加入青霉素、链霉素,-70e反复冻融3次以上,然后在4e7000r/min离心5min。上清分装保存。

细胞培养和增毒:用细胞生长液培养CRFK细胞,待长满单层后,消化、传代。同步接种已处理的病料样品,011~012mL/瓶,加入生长液后的总体积为10~15mL/瓶,置于37e,5%CO2培养箱中培养,第2天换上细胞维持液,连续培养3~4d,观察细胞病变,待细胞病变(圆缩、变形、脱落等)达到80%以上时,冻融3次收集上清病毒液,将此病毒液连续传代5次,观察其细胞病变,呈阳性者置-70e冰箱保存。

血凝和血凝抑制试验:按照文献[3]进行。病毒理化性质的鉴定:011mol/L盐酸调pH值310,37e作用1h;011mol/L氢氧化钠调pH值910,37e作用1h;50%氯仿处理,室温作用1h;50%甲醇处理,室温作用1h。

病毒粒子SDS-PAGE分析:SDS-PAGE方法按文献[4]进行。

动物感染试验:将供试幼犬分成2组,每组1只,试验组动物口服分离细胞培养病毒10mL;对照组动物口服生理盐水10mL;在感染后分开饲养,每天观察临床表现,每天测体温2次。

病毒DNA的提取:按照文献[4]进行。犬细小病毒VP2基因的扩增:以提纯的犬细小病毒DNA为模板,以引物1和引物2进行PCR扩增,反应程序为:95e预变性5min;95e45s,53e60s,72e

115min,35个循环;72e延伸10

min,1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

重组质粒的构建、转化及鉴定:按照文献[6]进行。212 病毒理化性质鉴定

病毒在酸性、碱性、氯仿、甲醛处理下,病毒效

[6]

价变化情况,如表1,均符合犬细小病毒特性。

表1 病毒血凝效价结果

处理试剂pH310pH91050%氯仿50%甲醛

处理时间

1h1h1h1h

处理前血凝价

26262626

处理后血凝价

2626260

213 病毒SDS-PAGE检测

SDS-PAGE检测病毒蛋白大小主要为ku,与

#62#AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine 2008 Vol140 No14

214 动物试验结果

犬细小病毒主要衣壳蛋白(VP2)大小一致。

用细胞分离病毒感染犬3d后,试验组幼犬发病,连续拉稀便,身体脱水,精神沉郁,食欲废绝。11d之后病犬转良,之后逐渐康复。粪便PCR检测

犬细小病毒,结果为阳性。

215 PCR扩增结果

提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,得到一个与预期值相一致的片段(2080bp),如图3。

216 PCR产物的克隆及酶切鉴定

根据文献[5]的方法,提取重组质粒pMD/VP2并用HindÓ和XbaI双酶切鉴定后,可见2条大小分别约为2692bp和2080bp的片段。表明成功构建了原核表达载体pMD/VP2。经上海英骏公司测序表明,与GenBank上犬细小病毒VP2片断同源性高达99%。

M1.DNAMarkerDL2000;M2.DNAMarkerDL15000;pMD/VP2质粒的HindÓ和XbaI酶切片断

1,2.

图5 pMD/VP2的酶切鉴定

217 犬细小病毒VP2基因生物信息学分析

经过序列测定,将其核酸序列和推导的氨基酸序列与CPV参考毒株进行了比较,第426位氨基酸残基和第555位氨基酸残基分别为Asp和Va。l根据经

[7]

典的分型方法,推断为CPV-2b型。

根据DNASTAR生物软件,对推测的VP2氨基酸序列进行分析。选取应易于位于或移动于蛋白质抗原表面,有利于与抗体结合,并具有一定柔韧性的氨基酸区域,预测作为B细胞蛋白抗原表位(见图6)。

犬细小病毒VP2片断的开放阅读框中,含有1755个碱基,其中A:612个占3419%;C:281个占1610%;G:351个占20%;T:511个占2911%。用标准遗传密码推测其氨基酸总数为584个,其中亲水电中性的氨基酸(N,C,Q,

S,T,Y)190个,

疏水氨基酸(A,I,L,F,W,V)177个,亲水酸性(D,E)和碱性(K,R)的氨基酸分别为54个和43个。

畜牧与兽医 2008年 第40卷 第4期#63#

图6 犬细菌病毒VP2蛋白B细胞抗原表位预测

综合以上3组数据,氨基酸顺序为5-30片段;300-320片段;360-380片段;380-400片段;400-420片段最有可能为B细胞表位区域。3 讨论

犬细小病毒是危害我国养犬业的主要流行性传染病之一,具有发病急、死亡率高等特点,对主要流行毒株的分离鉴定,是研究其发展规律的重要手段。本研究运用细胞培养、血凝与血凝抑制试验、动物感染试验、犬细小病毒VP2基因的克隆和序列分析等方法,分离到了一株犬细小病毒,并根据其VP2序列进行分型,确定为CPV-2b型。

犬细小病毒自1978年首次发现以来,病毒抗原不断演变,逐步发展成为CPV-2,CPV-2a,CPV-2b等多种亚型。最近发现的CPV-2c型,即300位氨基酸残基由Gly变成Asp,这导致了非常明显的抗原性质的改变,使得原来辨别分型的单抗丢失了识别位点,从而指定为CPV-2c。本研究所分离的犬细小病毒确定为CPV-2b型,与2005年国内主要流行毒

[9]

株有所区别;这样更说明我国犬细小病毒的抗原变异仍然迅速。

犬细小病毒为20面体的衣壳蛋白包装的DNA病毒,其衣壳主要由VP1、VP2、VP3蛋白构成,其中最为主要的是VP2蛋白,占90%。VP2也是CPV的免疫原性蛋白,编码CPV的主要抗原决定簇,可诱导机体产生中和抗体。因此对犬细小病毒VP2基因进行克隆不仅可以从分子水平上对病毒的进化作出判断,并监控其核酸变异状况,而且对日后表达VP2蛋白提供物质基础。

根据生物软件预测VP2蛋白B细胞抗原表位,

[10]

[8]

可以为设计CPV新型抗原肽疫苗,以及针对B细胞抗原表位的用于治疗的单克隆抗体提供依据;为今后对细小病毒的基因进行人工改造以提高细小病毒各基因在体内外的表达含量打下基础,能进一步更好预防和控制犬细小病毒病的流行。参考文献:

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