【doc】钙离子信号与细胞凋亡

钙离子信号与细胞凋亡

生物物理gg---4-一卷 ACTABIoPHYSICASINICA 第一期二oo五年二月 VOI.21No.1Feb.2005 钙离子信号与细胞凋亡 郭静,蒲咏梅,张东才

(科技大学生物系,中国)

摘要:细胞凋亡的分子机制是什么?这个问题当前引起人们广泛的研究兴趣.作为重要的第二信使,钙信号

在许多生理和细胞活动中都起到了十分重要的作用.钙信号是否也在凋亡的中起作用呢?虽然在过去十多年

中,许多研究证据都表明钙信号参与凋亡的,但是,钙信号如何作用于凋亡过程的具体机理仍然是众说纷

纭.事实上,许多研究结果仍存有争议.文章总结了近几年来大量关于钙信号与凋亡研究的成果,集中讨论了两

个问题:1)在凋亡前期\"决定阶段\"有没有钙离子信号的参与?2)钙离子信号与哪些凋亡因子(包括

Bcl一2族蛋白)相互作用及如何作用?这问题还牵涉到亚细胞结构中钙库的作用(包括细胞质,内质网和线粒体.

根据作者自己的实验结果,文章对这些文献中不同的说法作了一些具体的评估.最后,文章还提出了一个钙离子 信号参与细胞凋亡的可能模型.

关键词:钙离子信号:凋亡;线粒体;内质网;Bcl一2族蛋白;钙离子 中图分类号:Q249,Q255 1引言

凋亡,又名细胞程序性死亡,是诱导性的细胞

自杀过程,它使生物体可以有序地清除受损伤或无 用的细胞[】I.自从1972年JohnKerr第一次提出凋 亡这个概念后,人们发现它在多细胞生物的基本生 命活动中起着十分重要的作用.首先,它对于生物 发育过程中控制细胞数量平衡必不可少,例如,手 指的形成和神经元与靶细胞之间联系的建立都依赖 于器官中某些特定细胞群体的凋亡.凶此,细胞凋 亡的缺陷会导致严重的发育畸形[2J.同时,许多病 理过程,如缺血再灌注损伤,坏死,神经系统退行 性病变以及病毒侵害或化学毒性等都与凋亡有 关.此外,由基因变异而引起的细胞凋亡的抑 制会导致肿瘤的发生或化疗耐受的产生[1]]. 正因为凋亡在生理学及病理学上的重要性,过 去30年来,它引起了人们极大的兴趣.虽然近来 的研究揭示出凋亡是由十分复杂的信号传导通路所 的,但是,凋亡的具体机理仍然不十分清 楚.目前已知有_=.个主要的信号传导通路[13],它们 是:1)线粒体通路[14,15];2)死亡受体通路7J; 3)内质网通路.所有这些信号传导通路都能激 活凋亡执行者.caspase3,它会水解各种各样的细 胞成分而使其凋亡[19J.

在动物细胞中,线粒体通路是最普遍的凋亡机 制[20川.线粒体是这个通路中的核心(图1).简而 言之,细胞外或细胞内的凋亡信号会激发细胞质内 Bc1.2族促凋亡蛋白,如Bax的激活.然后,这些 凋亡的调节因子会转移到线粒体并且诱导线粒体膜 间质凋亡蛋白(如细胞色素C(cytochromeC, Cyt.C).Smac/DABLO(secondmitochondria- derivedactivatorofcaspase),凋亡诱导因子

(apoptosisinducingfactor,AIF)和核酸内切酶 G(endonucleaseG,EndoG)等)的释放l14.

细胞色素C是最关键的凋亡调节因子之一,从线粒 体释放后,它会与凋亡酶启动子(Apoptotic proteaseactivatingfactor.1,Apaf-1)结合,在有 脱氧三磷酸腺苷(dATP)存在的情况下,激活 Apaf-1[24J.活化的Apaf-1会结合procaspase.9而将 之切割和活化.活化的caspase.9会切割 procaspase.3并产生活化的caspase.3的四聚体]. 同时,由于胞质内的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor ofapoptosisprotein,lAPs)可通过结合caspase 的催化位点而抑制活化的caspaset,所以,线粒 收稿日期:2005—02—05

通讯作者:张东才,电话:852.23587326, 传真:852—23581559,E-mail:**************

LaboratoryofCellularCarcinogenesisandTumorPromotion, CenterforCancerResearch,NationalCancerInstitute,National InstitutesofHealth,Bethesda,MD202,USA

2生物物理

DeathreceptorsIrradiationChemicalreagents

(e.g.Tr,Fas,etc.)(e.g.UV;x—ray,~/-ray,etc.)(e.g.Thapsigargin,Taxol,etc.) ProteolysisandcelldeathActivecaspase-3

Fig.1Themitochondria-dependentsignalingpathwayofapoptosis.Manyextracellularorintracellularapoptotic

stimuli,includingdeathreceptors,irradiationorchemicalreagentscantriggertheactivationofthepro—apoptotic

Bcl-2familyproteinsinthecytoso1.Theseapoptoticregulatorswilltranslocatetomitochondfiaandinducethe

releaseofcytCfromitsinter-membranespace.ThereleasedcytCthenbindstoApaf-1andacti

vatesApaf-1in

thepresenceofdATP.TheactivatedApaf-1thenrecruitsprocaspase9andtriggersitsactivationby

auto-cleavage.Theactivatedcaspase-9inturncleavesprocaspase-3andgeneratesanactivetetramericform.The

catalyticsitesoftheprocessedcaspases,however,areimmediatelyboundedbythelAPs(inhibitorofapoptosis

proteins).Atthesametime,anotherreleasedmitochondrialproteinSmac/DABLObindstolAPsandremoves

themfromtheprocessedcaspases.Thecaspasesarenowfreetocleavetheirsubstratesandcausecelldeath.

体会同时释放出另一个线粒体蛋白Smac[2728],它可 通过结合imps而去除imps对caspase的抑制作用 从而使caspase的催化位点再次暴露_29J. 在死亡受体通路中,caspase一3的激活依赖于 细胞膜上死亡受体的活化[3o].当肿瘤坏死因子d (tumornecrosisfactord,TNFot)或Fas配体 (Fasligand)与它们在细胞膜上的受体结合时,会 促使受体三聚体的形成并通过胞质侧的死亡区域吸 引procaspase一8到细胞膜.活化的caspase一8可切 割procaspase一3,从而产生活化的caspase一3.此 外,caspase一8还可以通过切割而激活单BH3促凋 亡Bcl一2族蛋白(BH3onlyproapoptoticprotein) Bid.被切割的Bid会转移到线粒体引起膜间质凋 亡蛋白的释放_32].

在内质网通路中,caspase一3是被位于内质网

上的caspase一12所激活的_33].Caspase一12主要位于 内质网膜的胞质侧,当内质网的稳态被破坏,如内 质网钙离子排空时,caspase一12会被激活.有证据

一

显示caspase一12的激活依赖于钙调蛋白水解酶 (calpain)[341.其具体的机制仍然在探索中. 钙离子作为一个主要的细胞内信使,参与 许多细胞和组织的生理活动,包括肌肉收缩,新陈 代谢,分泌以及细胞_35.在静息生理状态下, 细胞内钙离子浓度总是保持在极低的水平,约为 10mol/L.细胞内外的钙离子浓度差大约为一万 倍.图2显示了细胞内钙离子分布及流动的调节机 制.当遇到相应的刺激时,细胞会通过多种途径 瞬间提高胞内局部或全部的钙离子浓度.有人发现 细胞内钙离子浓度在细胞死亡过程中有变化,并且 这种变化与许多病理状态相关,例如,心脏缺

血_3s-4o[,肌肉营养不良],脑缺血损伤[42,43]和低血糖 症等.

第l期钙离子信号与细胞凋亡3 Mitochondria

Fig.2TheregulationofintracellularCa2+compartmentalization.CellularCaimportthroughtheplasma

membraneOCCBrSlargelybyreceptor

operated(forexample,glutamatereceptors),voltage?sensitiveand store

——

operatedchannels.Onceinsidethecell,CacaneitherinteractwithCa2+-bindingproteinsorbecome

sequesteredintotheendoplasmicreticulum(ER)ormitochondria.ThelargestCa2storeincellsisfoundinthe

ERorsarcoplasmicreticulum,withlocalCa2~concentrationsreachingmillimolarlevels.Ca2+levelsintheERare

affectedbytherelativedistributionofSarCO(endo)plasmicreticulumCa2+-ATPase(SERCA)pumpsandof

十

inositol—l,4,5一

trisphosphate(Ins(1,4,5)P3)receptors(Ins(1,4,5)P~Rs)andryanodinereceptors(RVRs),aswellasby

therelativeabundanceofCa2--bindingproteins(calreticulin,calsequestrin)intheERorsarcoplasmicreticulum.

ThecytosolicCa2concentrationinunstimulatedcellsiskeptatl00nmo1/LbybothuptakeintotheERand

Cextrusionintotheextracellularspacebytheplasma-membraneCa2+-ATPase(PMCA).ERCa2+releaseis

triggeredbyagoniststimulationthroughthegenerationofIns(1,4,5)P3throughhydrolysisofphosphatidylinositol-4,

5-bisphosphate(PtdIns(4,5)P9operatedbyaphospholipaseC(PLC~/).ThemitochondriatakeupC矿

electrophoreticallythroughauniporttransporterandcanreleaseitagainthroughthreedifferentpathways:reversal

oftheuniporter,Na+/H+-dependentCa2exchange,orasaconsequenceofpermeabilitytransitionpore(PTP)

opening.ThePTPcanalsoflickertoreleasesmallamountsofCa2+.Ca2effluxfromcellsisregulatedprimarily

bythePMCA,whichbindscalmodulinandhasahighaffinityforCa2+.Ca>effluxmightalsobemediatedby

theNa*/Ca~-exchanger(NCX).

【

Ca2十～

十],calciumconcentration;DAG,diacylglyceride.(Reproducedfromreference [37】withpermissionfromNatureReviewsMolecularCellBiology). 2钙信号是否参与凋亡?

早在1974年,Fleckenstein等就提出钙离子 可能参与某些重要的细胞死亡过程,他们发现过多 钙离子进入心肌细胞会导致细胞死亡,这可能是缺 血时造成心肌病变的机制.随后的研究中,人们通

过应用钙离子载体A23187(增加细胞质内钙离子 浓度)或钙离子螯合剂(抑制细胞质内钙离子浓度 的增加),进一步证明了细胞质内钙离子浓度的增 加可能导致细胞死亡.有结果表明A23l87可以模 拟皮质类固醇激素所引起的淋巴细胞的死亡,相 反,用乙二醇双四乙酸(EGTA)螯合培养液中的 钙离子可以抑制皮质类固醇激素的作用.可是, 由于当时对细胞凋亡的认识仍比较局限,所以这些

4生物物理2005笠

钙离子浓度升高所导致的细胞死亡究竟是坏死 (necrosis)还是凋亡(apoptosis)并不清楚.其 后,随着对细胞凋亡认识的不断提高,人们逐渐意 识到钙离子可能参与凋亡的过程.McConkey与 Orrenius的研究小组[47-58]在早期运用各种凋亡的诱 导剂和细胞模型进行了一系列的工作,他们的结果 表明核酸内切酶的激活和细胞凋亡依赖于早期持续 的细胞质内钙离子浓度的升高.其后不久,在许多 其它的凋亡系统中也得到了类似的结果[59~61]. 虽然早先的研究有力地表明钙离子可能在凋亡 的信号传导通路中起到了十分重要的作用,但是, 一

些重要的问题仍然没有解决.第一,钙离子载体 的试验结果仅仅表明细胞质内的高钙水平可诱导细 胞死亡,并不表明细胞质内钙离子浓度的升高是其 它在生理及病理情况下发生的凋亡过程所必需的; 第二,上述研究中,人们就所观察到的细胞质内钙 离子浓度的升高是凋亡的结果还是原因仍然存在争 议.为了更有说服力地证明细胞质内的钙离子信号

参与凋亡的调节,必须证明阻止了细胞质内钙离子 浓度的升高会抑制凋亡.

因此,许多研究小组在实验中运用膜可通透的 钙离子螯合剂(BAPT～AM)抑制细胞中的钙信 号来研究细胞质内钙信号与凋亡的关系[62-72].但 是,结果却非常有争议.虽然有些研究显示

BAPTA/AM可以在一定程度抑制凋亡[65-68],其它的 一

些报告却指出BAPTA/AM根本不能抑制凋 亡[62.在某些情况下,人们甚至发现

BAPTA/AM本身就可以诱导脱氧核糖核酸的裂解 (DNAfragmentation)和细胞死亡].由于这些实 验结果,近几年来有些实验室认为钙离子信号并不 参与某些凋亡过程的,例如,有研究显示在锌 离子的螯合剂TPEN诱导的胸腺细胞的凋亡中,胞 内钙离子浓度并无升高,而且应用钙离子螯合剂对 凋亡也没有影响[74].McFarlane等也发现在TNF诱 导的HeLa细胞的凋亡中,没有钙离子信号的变 化,同时,应用钙离子螯和剂EGTA和

BAPTA—AM以及Ca+-ATPase抑带0齐0thapsigar— gin,均对细胞凋亡没有影响[72].

为了阐明细胞质内钙离子是否参与凋亡这 个问题,我们进行了一系列的试验来研究不同类型 的钙离子信号阻滞剂对紫外线[75]和过氧化氢所诱导 的凋亡的影响.我们发现,膜可通透性的

BAPTA/AM只能抑制过氧化氢诱导的成神经细胞 瘤细胞(neuroblastomacel1)的凋亡(未发表的数 据),而不能抑制紫外线所诱导的海拉细胞(HeLa cel1)的凋亡(图3A).但是,膜非通透性的

BAPTA可以抑制紫外线所诱导的海拉细胞(HeLa cel1)的凋亡(图3B).我们的研究结果无疑表明 在这两个系统中,阻止细胞质内钙离子浓度的升高 可以显着抑制细胞凋亡.另外,在HeLa细胞中, 当应用内质网膜1,4,5一三磷酸肌醇受体(inositol 0

TimeafcerUV—irradiation

Fig.3TheeffectofBAPTA/AM,BAPTAandhepafin onUV—inducedapoptosisinHeLacells.(A)Percent OfUV—inducedapoptoticcellsasafunctionoftime withorwithoutpre?-treatmentofmembrane?-impermeant BAPTA/AM.口:Control;一:BAPTA/AM.rB1Percent OfUV—inducedapoptoticcellsasafunctionoftime withorwithoutpre—loadingofmembrane—permeant BAPTA.口:Control;一:BAPTA.rC1Percentof UV—inducedapoptoticcellsasafunctionoftimewith orwithoutanIP3Rblockerheparin.口:Control; 一:Hepafin.(Reproducedfromreference[751). ∞加∞如∞如加m ㈧㈣㈣

第1期钙离子信号与细胞凋亡

1,4,5.triphosphatereceptor,IP3R)的拮抗剂肝素 (heparin)来阻止钙离子从内质网的释放时,我们 也得到了相似的结果(图3C).我们这些发现有力 地表明细胞质内钙离子浓度的升高的确参与驱动凋 亡进程的信号传导.

我们认为上文提到的BAPTAM的不同效果 可能是由于它对不同亚细胞分布的钙离子的不同作

用造成的.因为BAPTAdAM是膜可通透的,在一 些细胞中它进入细胞膜的同时也可以进入细胞器, 如内质网,并在其中蓄积.因此,BAPTA/AM不 仅可以阻止细胞质内的钙离子浓度的升高,它还可 能螯合内质网腔内的游离钙离子.因为内质网钙离 子的排空可以激发凋亡【18,62],所以在一些凋亡的模 型中,BAPTAdAM可能会产生这种副作用从而促 进凋亡.这种副作用在使用膜非通透性的BAPTA 或者hepafin时就可以完全避免.因此,有些研究 如果只凭BAPTA/AM不能降低凋亡就认为细胞质 内钙信号并不参与凋亡的,其结论是站不住脚 的.

3是否有早期钙信号参与凋亡中线粒 体膜通透的上游传导通路?

凋亡的过程包括两个主要的阶段:早期的决定 阶段(commitmentphase)和后期的执行阶段 (executionphase).有报告指出在凋亡的执行阶段 可观察到细胞质内持续的钙离子浓度的升高[53～5458]. 人们相信这种持续的钙离子浓度的升高参与了脱氧 核糖核酸的裂解[49,8].而更令人关注的问题是, 钙离子是否参与凋亡早期的信号传导?以前的研究 表明钙离子可能会作用于凋亡通路中线粒体细胞色 素C释放或caspase一3激活的上游,例如,有人指 出细胞质内钙离子浓度的升高可能直接作用于线粒 体,导致离体的线粒体肿胀并释放细胞色 素c【'\".

为了更有力地回答这个问题,必须解决两点: 第一,直接测量细胞质内钙离子的浓度以证明钙离 子浓度的变化发生在凋亡的早期;第二,用钙信号

阻滞剂汪明凋亡可以被抑制在早期阶段.凶为在不 同的细胞中凋亡的发生是不同步的,所以要在细胞 群体中捕捉瞬间的钙离子的升高(假如有的话)是 很困难的.因此,为了测定凋亡过程中细胞质钙离 子浓度的动态变化,单一细胞测量技术是必不可少 的.当然,在单个哺乳动物细胞中直接测量细胞质 钙离子的浓度并不容易,这需要高精确度及敏感度 的成像工具.在几年以前,已有一些关于在单个活 细胞中测量凋亡中细胞质钙离子浓度的报告,例如 用tiara.2的比率成像,在HL.60凋亡细胞中, Lennon等[82]观察到凋亡晚期细胞内钙离子浓度的 升高.根据他们的解释,这些升高显然是凋亡的结 果,而不是原因.用钙离子敏感的荧光探针 Fluo.3,在抗Fas一抗体处理的Jurkat细胞中, Scoltock等发现1～2小时后细胞内钙离子浓度持续 地升高.但是,这种细胞内钙离子浓度的增加被证 明只是脱氧核糖核酸裂解选择性的必要条件,并不 是早期的凋亡活动【83_.然而,Tagliarino等V4]发现 在B.Lapachone处理的MCF.7细胞加药后几分钟 内细胞质内有早期钙离子短暂的升高.他们相信这 一

细胞内钙离子浓度的改变在线粒体上游凋亡的早 期信号传导通路中起到了关键作用.

为了近一步探索这个问题,我们应用高度敏感 的钙离子荧光探针(连接了l0ku右旋糖苷的 calciumgreen一1),测量了在紫外线或TNF诱导 的HeLa细胞[851及过氧化氢诱导的成神经细胞瘤细 胞凋亡的两个模型中细胞质内钙离子浓度的变化. 在紫外线或TNFd诱导的凋亡中,我们发现有部分

的HeLa细胞在凋亡的早期阶段显示出一系列反复 的钙峰(图4).这些瞬间的细胞内钙离子浓度的 fA1 fB1

Fig.4Samplerecordsshowingthedynamicchangeofthe integratedfluorescencesignalofCaGn-linHeLacells

undergoingUV—inducedapoptosisfA,or丁NF—n—induced apoptosis(B).

I_口r1『100口Q∞0'10一 ■口J工o0口03S0_l0=

6十物物理

增高似乎在细胞色素C释放的上游,凶为当钙离子 浓度的升高被抑制时,细胞色素C的释放也被有效 地抑制和推迟了.在第二个模型中,我们发现在成 神经细胞瘤细胞中,在最初的3分钟内,过氧化氢 可导致钙离子浓度快速的升高,其后是缓慢持续的 钙离子浓度的升高.螯合细胞内钙离子浓度的升高 也可以抑制细胞凋亡和细胞色素c的释放(未发 表的数据).这些结果有力地表明,在线粒体上游, 早期的钙离子信号在凋亡的进展中有重要作 用[85].

实际上,一些间接的证据也显示了细胞质内钙 离子浓度的增加参与早期凋亡活动.例如,当在神 经酰胺预处理的细胞中应用_一磷酸腺苷时,胞质内 会产生IP相关的钙峰,从而促进细胞色素C的释 放.而且,有报告指出通过调节IP受体所引起 的钙离子浓度的升高可以直接细胞死亡机制. 疆差

当I型lP受体缺乏时,地塞米松,电离辐射,T 细胞受体或Fas的激活都不能引起细胞质钙离子的 升高,同时凋亡也会被抑制,而在IP受体缺乏的 T细胞上表达恒定活化的钙调神经磷酸酶A (calcineurinA)后,细胞对凋亡诱导剂的敏感性 可以恢复[87,88].所以,从我们的直接实验结果及其 它的研究提出来的间接证据,都显示有一个早期的 钙信号参与了细胞凋亡的.从我们对紫外线及 TNFo/.诱导的凋亡的研究中可以得知,在凋亡过程 的不同阶段中可能有多种钙离子浓度的变化(图 5).在凋亡早期的\"决定阶段\钙信号显然是调 控机制中重要的一环.至于在\"执行阶段\"观察到 的钙离子浓度的升高,虽然据称与脱氧核糖核酸的 裂解在时间上吻合,但仍未有充分的证据显示它在 功能上的重要性.因此不能排除这个晚期升高的钙 信号可能是由凋亡产生的副作用. TimeafterUV—irradiation(min)

Fig.5DynamicchangeofthefluorescencesignalofCaGn一1andcellsizeduringthe commitmentphaseandtheexecutionphaseofUV—inducedapoptosisinHeLacells. ——

:Fluorescence;…△…:Cellsize

4钙信号~nt.--I与凋亡的信号传导通路 相互作用?

虽然钙离子信号的确参与了早期的凋亡活动, 但是,对于钙离子信号如何激发早期凋亡活动的确 切机理仍然不清楚.人们只知道钙离子的作用很可 能是通过钙离子依赖的酶起作用,至于通过哪种酶 及酶的底物,则仍需要进一步的探索.目前,已经 有大量的研究朝这个方向发展.

4.1细胞质内钙信号的下游标靶 4.1.1钙调蛋白分解酶(calpain)

许多研究表明calpain可能作用于细胞质内钙 离子的下游来激活凋亡的过程.可能的calpain的 标靶包括:1)calpain可以切割并激活Bax[].有 报告指出calpain可以切割Bax的N端,产生一个 强力促凋亡的l8ku的较大片断,从而促进细胞色 素C的释放[9c~92].不过,我们实验室通过使用融合

第l期钙离子信号与细胞凋亡

绿色荧光蛋白(GFPgene—fusion)技术显示,在紫 外线诱导的凋亡过程中,这个建议的机制并未在活 细胞内发生,因而在某些凋亡过程中,这个机制并 不成立.2)calpain可以通过切割激活Bid.有人 发现在人黑素瘤细胞中,凋亡诱导剂cisplatin可以 使Bid被切割,产生一个l4ku的片段,从而激 发离体的线粒体中细胞色素c的释放.Chen等 的工作也显示在体外情况下重组的Bid也可以被 calpain切割成片段而激发细胞色素C的释放. 3)位于内质网的caspase一12的激活也依赖于cal— pain的活化.有证据显示calpain抑制剂可以抑制 内质网应激所诱导的caspase.12的活化.4)cal— pain可以切割x染色体连锁的凋亡抑制蛋白(x— chromosome—linkedinhibitorofapoptosisprotein, XIAP)而去除其对capases的抑制作用.

Kobayashi等】近来的研究显示在体外的情况下 calpain可切割XIAP,使其不能与caspase一3的催 化位点相结合.5)calpain可以通过激发cal— cineurin依赖的通路促进凋亡.近来有报告显示

calpain可通过切割calcineurin的内源抑制剂 cain/cabin1,使calcineurin从抑制剂释放出来并激 活calcineurin依赖的凋亡通路.我们的研究也发 现calpain的抑制剂可以显着抑制紫外线诱导的 HeLa细胞凋亡中细胞色素C的释放及凋亡细胞的 数量(图6B).

4.1.2钙调神经磷酸酶(calcineurin)

calcineurin的抑制剂环孢霉素A可以抑制某些 凋亡过程的研究使人们认识到calcineurin可能参与 凋亡的[97,98].体外的研究显示活化的 calcineurin可以使Bad去磷酸化,使其与抑制蛋白 14—3—3解离,然后转移到线粒体激发细胞色素C的 释放.而且活化的calcineurin可引起基因转录的 改变,这也可能是一个凋亡的机制【too].因此, calcineurin作为钙离子信号的下游是可以作用于线 粒体上游的早期凋亡阶段的.此外,在我们的实验 中,我们也观察到calcineurin抑制剂的确可抑制紫 外线诱导的HeLa细胞的凋亡中细胞色素c的释放 及凋亡细胞的比例(图6A).

Fig?6(A)Effectsofapplicationofacalcineurin(CN)auto—inhibitorypeptideonUV—inducedapoptosis inHeLacells.

口:Control;-:CNinhibitor.(B)TheprotectiveeffectofcalpaininhibitorfALLN)on uv—inducedapoptosisinHeLacells.口:Control;■:ALLN 4.1.3DAP激酶

DAP激酶是一族死亡相关的蛋白激酶]tot,to2]. 它们的调节机理与CaMKII十分相似,即含有一个 自体抑制的CaM结合区域.而且,DAP激酶还含 有一个C末端的自体抑制的死亡区域].正如

CaMKⅡ一样,DAP激酶的激活依赖于细胞中钙离 子浓度的升高[101,102].有报告显示DAP激酶参与 TNFo~或Fas诱导的凋亡[103].但是DAP激酶如何 凋亡过程的机理仍然不清楚. 4.1.4对线粒体钙稳态的直接作用

近来,人们发现线粒体的钙超载在某些凋亡中 起到了至关重要的作用04].那么,线粒体中升高 的钙离子来自哪里呢?有人认为线粒体中的钙离子 可直接来自细胞质.有研究显示,虽然细胞质内钙 离子升高的平均水平不超过微摩尔浓度,但是,长 时间的蓄积也会增加线粒体内钙离子的浓度[105,106]. 另外,在内质网和线粒体外膜的近距离的接触区域 内,从内质网释放的钙离子也可以几乎直接流入线 粒体.有人发现线粒体钙离子的摄取发生得很快并 且依赖于内质网膜上受体开口处细胞质内钙离 子的浓度梯度[10].通过这些途径所产生的线粒体 钙离子的聚集会直接破坏线粒体膜电位,从而引起 5O5O5O5O 13,,'1l

∞一一..pa∞矗一.J...lJ. )B 65432l

∞一一...∞盘一.J_..lJ0 )A

8生物物理2005在

线粒体膜间质凋亡蛋白的释放].有人提出线 粒体钙离子的主要标靶是线粒体通透性转换孔 (mitochondrialpermeabilitytransitionpore,

PTP)[1131.一些研究显示PTP参与线粒体凋亡因子 的释放,如细胞色素C(参考综述[21]).近来, Rizzuto的研究小组…报告高表达PTP的组成成分 之一的VDAC(voltage.dependentanionchanne1) 可以加强IP受体介导的线粒体钙离子的摄取和神 经酰胺所引起的凋亡.然而,关于PTP的开放是 否会造成线粒体蛋白的释放仍然在争论中[1l4~121]. 根据我们在单个活细胞中的研究,我们认为PTP 在凋亡中的作用可能是参与控制线粒体钙离子的流 通而不是细胞色素C的释放Ill9]. 4.2钙信号与Bcl一2族蛋白的相互作用 Bc1.2族蛋白包括多至4个保守的BH区域 (Bc1.2homologydomain).根据不同的结构和功 能特征,Bc1.2族蛋白可分为两类,即抗凋亡和促 凋亡蛋白.抗凋亡蛋白包括Bc1.2和其它5个相关 蛋白(Bc1.xL,Bc1.w,Al,Mc1.1,Boo/Diva). 促凋亡蛋白则可再分为两组:多区蛋白(the multi.domainproteins),如Bax,Bak和Bok等; 单BH3蛋白(BH3domainonlyproteins),如 Bid,Bad,Bim等[26].近几年来大量的研究表 明,在细胞质及线粒体外膜上,Bc1.2族抗凋亡蛋 白可以通过中和Bc1.2族促凋亡蛋白来抑制细胞凋 亡【24].然而,近年来,Bc1.2族蛋白在内质网上的 作用受到越来越多的关注.因为钙离子在细胞 凋亡中起着重要的作用,而内质网又是参与钙 离子稳态的主要细胞器,所以位于内质网上的 Bc1.2族蛋白如何钙离子的稳态引起人们浓厚 的兴趣[7]. 4.2.1Bc1.2

尽管人们认为Bc1.2主要是在线粒体上起作 用,但在某些细胞类型中,它还分布于其它细胞内 膜结构,例如内质网和核膜.早在十年前人们就开 始了关于Bc1.2调节细胞内钙离子稳态的研 究[I230].当时的研究发现在细胞失去生长因子时, Bc1.2可抑制钙离子从内质网的释放,从而抑制钙 离子的波动和钙离子从内质网到线粒体的重新分 布.随后越来越多的研究结果证实了这个理论.例 如,Distelhorst研究小组[131,132]的工作表明Bc1.2可 以抑制钙离子从内质网的释放并维持内质网中钙库 的水平.他们最近的研究还发现Bc1.2可以直接抑 制钙离子通过受体通道从内质网的释放.这种 抑制作用不是由于IP受体的表达水平或内质网腔 内钙离子浓度的改变,而是由于Bc1.2与IP受体 之间的相互作用抑制了II)激发的离子通道的开放 而引起的[133].然而,另外一些研究小组(包括 Rizzuto等)发现了很不一样的结果,他们直接测 量了内质网腔的钙离子浓度,发现Bc1.2的高表达 可以降低稳定状态下内质网内的钙离子浓度,从而 降低了激发时可释放的钙库的水平[104,1.有报告 指出Bc1.2可能是通过增加钙离子从内质网的渗漏 来起作用的34?36].另外,Bc1.2还可以降低内质网 腔内钙结合蛋白(calreticulin)以及钙泵(SER. CA2b)的表达从而降低内质网内的钙离子浓度. 与Rizzuto等研究小组的研究结果一致的是,最近 发表的一些文献证实降低内质网内钙离子浓度可以 抑制细胞凋亡,而增加内质网内钙离子的浓度则可 以增加细胞对凋亡的敏感性[18,104,137]. 可见,这些关于Bc1.2的作用的研究结果显示

了两点重要的争议:1)Bc1.2是否可以降低内质网 内的钙离子浓度?2)Bc1.2是抑制还是促进钙离子 从内质网的外流?有学者认为导致争议的原因可能 有:其一是由于有些研究缺乏对内质网腔内的钙结 合蛋白等一系列可以影响钙稳态的蛋白表达变化的 检测;其二是由于几乎所有的研究都是使用高表达 的Bc1.2,而不是研究内源性Bc1.2对钙离子的作 用[138].然而,从他们的研究中我们可以看到,无 论Bc1.2的作用是降低内质网内的钙离子浓度还是 抑制钙离子的释放,它的最终结果都是降低可诱导 的细胞质内钙离子浓度的升高,从而抑制钙离子相 关的凋亡的发生(图7).目前,关键的问题是: Bc1.2引起的内质网钙渗漏的增加到底是通过什么 机制?至今关于内质网渗漏通道的分子基础及功能 仍不清楚.目前主要存在两种推测,首先,凶为有 证据显示Bc1.2族蛋白可以在质膜上形成离子通 道[139,140],所以有研究者推测Bc1.2的高表达所造成 的内质网渗漏的增加可能是由于Bc1.2的离子通道 的特性所致【n5].然而,目前对于Bc1.2是否可以介 导钙离子的通过仍不清楚.另外一个关于Bc1.2增 加内质网渗漏机理的推测是Bc1.2可以作用于已经 存在于内质网上的通道,比如在静息状态时的钙离 子释放通道(如IP3受体或Ryanodine受体).目 前,我们只能等待这一领域更为深入的研究才能够 回答这些问题.

第1期钙离子信号与细胞凋亡9

Fig.7RegulationofCareleasefromERbyBcl一2,Two possiblewaysinexplainingtheeffectofBcl一2onERCa

signalinghadbeensuggested:(A)Reducetraffic,Bcl一2 wasshowntoreducetheERCareleaseduetoa

functionalinteractionofBcl一2withIP'sthatinhibited theirchannelopeninginresponseto1P3.fB1Reduce source.ItwassuggestedthatBcl一2candecreasethesteady stateCaconcentrationintheendoplasmicreticulum(ER) byincreasingtheCaleakageacrosstheERmembrane,It isnotyetclearwhethertheenhancedleakageofCais throughchannelsformedbyBcl一2itselforthroughthe interactionofBcl一2withexistingchannels,suchasIP3Ror RyR.

另一方面,由于PTP可释放线粒体基质中的 钙离子,有报告显示Bc1.2可以通过抑制PTP的开 放而增加线粒体存储钙离子的能力[14l~143].因此, 在内质网和线粒体上的Bc1.2有可能通过降低内质 网内游离钙离子的释放或增加线粒体对高钙水平的 耐受而抑制凋亡. 4.2.2Bax/Bak 有