维普资讯 http://www.cqvip.com ２００８年７月 中国比较医学杂志 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｊｕｌｙ，２００８ Ｖｏ１．１８ Ｎｏ．７ 第１８卷第７期 研究报告￥ （ ！； ， ； 、 、 、 ＴＮＮＩ２突变转基因小鼠模型的建立 杨 葳。，郑志红。，姜 淼 ，李兆阳。，王 惟’，王禄增。 （１．中国医科大学实验动物部，沈阳 ｌ１０００１；２．辽宁省计划生育科学研究院，沈阳 ｌ１００３１） 【摘要】 目的 建立ＴＮＮ１２突变转基因小鼠模型。方法 构建ｐＥＧＦＰ－ｔｎｎｉ２转基因构件，ＴＮＮＩ２基因的第１７５ 个氨基酸缺失，通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因ｐＥＧＦＰ．ｔｎｎｉ２注射入ＢＤＦ１小鼠受精卵中。胚胎 移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ方法检测子代鼠尾ＤＮＡ鉴定基因型。通过 ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｔｎｎｉ２基因表达。结果移植注射胚胎ｌｌ５枚给４只假孕小鼠共出生了２３只后代鼠。经ＰＣＲ和 Ｓｏｕｔｈｅｎ方法检测得到４只阳性小鼠。对其子代进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，ｔｒｎｎｉ２基因在肌肉、心脏内表达。结论 通过显 微注射法使外源基因ｐＥＧＦＰ—ｔｎｎｉ２（ＴＮＮＩ２基因的第１７５个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合，建立了转ｐＥＧＦＰ． ｔｎｎｉ２的转基因小鼠模型。 【关键词】ＴＮＮＩ２突变；显微注射法；转基因小鼠 【中图分类号】Ｒ．３３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７１—７８５６（２ｏｏ８）ｏ７—０００１．０４ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＮＩ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ ＹＡＮＧ Ｗｅｉ‘。ＺＨＥＮＧ Ｚｈｉ—ｈｏｎｇ‘，ＪＩＡＮＧ Ｍｉａｏ２。Ｌ１ Ｚｈａｏ－ｙａｎｇ‘，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ 。ＷＡＮＧ Ｌｕ—ｚｅｎｇ （１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｎａ ｍｅｄｉｃａｌ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １０００１，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １００３１，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＴＮＮＩ２ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｍｅ￣ｏｄｓ ｐＥＧＦＰ－ｔｎｎｉ２（Ｐ． Ｋ１７５ｄｅ１）ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｉｆｅｄ，ｔｈｅｎ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｅｇｇｓ．Ｔｈｅｓｅ ｅｇｇｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｇａｎｔ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｆｏｕｎｄｅｒｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｎｎｉ２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ＢＤＦ１ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｍｌｃ ｒｏｌｎ ｊ‘ｅｃｔｌ ｏｎ．ＰＣＲ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ４ ｏｆ ２３ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ．Ｔｗｏ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄｅｒｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ＲＴ． ＰＣＲ，Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴＮＮＩ２ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ＴＮＮＩ２ ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ 远端关节弯曲（ｄｉｓｔａｌ ａｒｔｈｒｏｇｒｙｐｏｓｉｓ，ＤＡｓ）是一种 先天性多发性关节挛缩畸形遗传病…。当前对于 ＤＡｓ的遗传学研究主要集中在与肌肉和肌腱形成相 关的基因上，肌钙蛋白Ｉ２ （ＴＮＮＩ２）就是相关基因之 一建立了ＴＮＮＩ２突变的转基因小鼠模型，为研究远端 关节弯曲疾病提供了很好的动物模型。 １材料和方法 １．１ ＴＮＮＩ２基因克隆、突变及转基因构件制备 ，其编码快反应骨骼肌肌钙蛋白的Ｉ亚基 从小鼠肌肉组织中提取总ＲＮＡ，反转录为 ｅＤＮＡ后，按ｔｎｎｉ２ ｍＲＮＡ序列设计正反向引物，Ｐｌ： ５ ．ＴＣＡ ＡＧＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＡＧＣ ＧＣＡ ＡＣ． （ｔｒｏｐｏｎｉｎＩ，ＴｎＩ）。目前有研究 表明在中国患有 ＤＡ２Ｂ的家庭中ＴＮＮＩ２基因的第１７５个氨基酸缺失 是导致该病的重要原因。本研究通过显微注射法， ［基金项目］辽科发［２００５］３６号，辽宁省重点实验室专项资金。 ３ ；Ｐ２：５ ．ＴＡＧ ＧＴＧ ＣＴＹ ＣＣＣ ＣＡＡ ＴＧＧ ＴＡ．３ 利用 ［作者简介］杨葳（１９８０一），女，研究方向：实验动物转基因。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｗｅｉ５２５５＠ｓｉｎａ．ｔｏｎｉ ［通讯作者］王禄增。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎ￣ｌｚ＠１６３．１３０１１１ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２ 中国比较医学杂志２００８年７月第１８卷第７期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ ＭｅｄＪｕｌｙ ２００８。Ｖｏ１．１８．Ｎ０．７ ＥａｓｙＡ酶进行ＰＣＲ扩增５９０ｂｐ片段，ＰＣＲ反应条件： ９４℃，５ ｍｉｎ预变性，然后９４℃，４５ ｓ，６０℃，４５ Ｓ，７２℃， １ ｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物纯化 后按照ＩｎｓＴ／Ａｃｌｏｎｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（＃ Ｋ１２１４，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）试剂盒说明连接到ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ 载体上，将连接产物转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ后进 行质粒扩增并测序。 测序结果正确的质粒通过ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ｒ）Ⅱ Ｓｉｔｅ—Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司），设计引 物将第１７５个氨基酸缺失，转化ＸＬ１，Ｂｌｕｅ感受态细 胞，进行质粒扩增并测序。 将已经突变后的质粒ｐＴＺ５７Ｒ．ｔｎｎｉ２，用ＥｃｏＲ Ｉ 和ＢａｍＨ Ｉ酶切，回收目的片断并连接到ｐＥＧＦＰ．Ｃ３ 载体的ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ位点，转化、筛选并测序鉴 定。所得阳性克隆质粒经ＡｐａＬＩ酶切后用１％琼脂 糖凝胶电泳回收目的片段，用ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ试剂盒纯化回收约５６００ ｂｐ长的目的片段。纯化 后ＤＮＡ溶于Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）中，注射浓 度为３ ｎｇ／￣Ｌ。 １．２显微注射及Ｆ０代鼠的产生 将纯化后的ｐＥＧＦＰ．ｔｎｎｉ２片断通过显微注射法 注入ＢＤＦ１小鼠受精卵雄原核中，将注射后状态良 好的受精卵移植到ＩＣＲ假孕母鼠的输卵管内，待Ｆｎ 代鼠产生。所有实验用小鼠均在屏障动物房中饲养 和繁殖，温度控制在２２￣（２，自动光控（１２ ｈ明／１２ ｈ 暗）。 １．３转基因鼠的检测 １．３．１ 鼠尾基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ检测：（１）按文献 ［４］方法进行鼠尾基因组ＤＮＡ的提取；（２）进行ＰＣＲ 检测：ｐＥＧＦＰ－ｔｎｎｉ２ Ｐｒｉｍｅｒ ｕｐ ５＇－ ｒＧＧＴＣＣ ｒＧＣ ｒＧＧＡＧＴ ＴＣＧＴＧ－３ ；ｐＥＧＦＰ－ｔｎｎｉ２ Ｐｒｉｍｅｒ ｄｏｗｎ ５＇－ＴＣＡＧＡＴｒＣＴＣＧ ＧＣＧＧＣ，ＩｆＩＴＩ＇ｃ．３ 。利用这对引物合成的ＰＣＲ产物长 度为２４７ ｂｐ。ＰＣＲ反应条件：９４ｏＣ ５ ｍｉｎ预变性，然 后９４℃，４５ ｓ；６５ ｏＣ，４５ ｓ；７２ ｏＣ，４５ ｓ，３５个循环，７２℃， １０ ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳观察结果。ｐＥＧＦＰ． ｔｎｎｉ２作为阳性对照，正常ＢＤＦ１鼠尾ＤＮＡ作为阴性 对照，同时设有空白对照。 １．３．２ 鼠尾基因组ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测：参考文献 ［４］中的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测方法，ＰＣＲ检测阳性小鼠和正 常ＢＤＦ１小鼠（阴性对照）基因组ＤＮＡ（约２０ ｇ）用 ＢａｍＨＩ酶切后ｌ％琼脂糖凝胶电泳，质粒ＰＣＲ产物 ２４７ ｂｐ片段作为阳性对照，用毛吸印迹法使ＤＮＡ转 移到尼龙膜上，紫外交联固定ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增的 ，ｔｎｎｉ２片段纯化后 Ｐ标记并进行杂交，洗膜，一７０￣Ｃ 放射自显影。 １．３．３转基因小鼠不同组织ＲＴ．ＰＣＲ检测：选取转 基因子代小鼠的心、肝、肌肉、肾、肺等组织，使用 Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取其组织总ＲＮＡ。对提取的ＲＮＡ在反 转录实验前进行ＤＮａｓｅＩ处理并用酚、氯仿抽提以去 除残留基因组ＤＮＡ。采用Ｐｒｏｍｅｇａ ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒 进行反转录ｃＤＮＡ及ＰＣＲ扩增进行ＲＮＡ水平表达 的分析。Ｔｎｎｉ２基因ＰＣＲ条件同上。以小鼠 ．ａｃｔｉｎ 基因设为内对照，／３－ａｃｔｉｎ Ｐ１：５＇－ａｇｇ ａｇａｔｃａｃａｇｃｃｃｔａｇｃａ． ３ ，Ｐ２：５＇－ｔｇａｇｇｃｔａｇｃａｔｇａｇｇｔｇｔｇ－３ 。，小鼠８－ａｃｔｉｎ ＰＣＲ扩 增条件为：９５℃，５ ｍｉｎ；９４℃，４０ ｓ；６０￣Ｃ，４０ ｓ；７２℃，４０ ｓ，３０个循环，７２￣（２，１０ ｍｉｎ。琼脂糖凝胶电泳分析结 果。 ２ 结果 ２．１ ｏＥＧｒＴ．ｔｒｍｉ２突变后测序结果 测序结果显示，第１７５个氨基酸（ＡＡＧ）缺失（图 １） Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ ｈ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ａ １‘Ｇ Ｔ Ｔ ｈ ， Ａ … 邈 ＧＡＡ缺失 ’ ｌ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ 矗 矗 Ｃ矗 Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ｂ 图１测序结果Ａ．野生型；Ｂ，突变型（反向互补链） Ｆｉｇ．１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｓｕｌｔ Ａ．Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ：Ｂ．Ｍｕｔａｎｔ（１ｅｖｅＩ ｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ） ２．２ Ｆ０代转基因小鼠产生 共注ｌ１５枚受精卵，存活８２枚，分别移入４只 ＩＣＲ小鼠输卵管，出２３只Ｆｎ代转基因小鼠。 ２．３ Ｆ０代转基因小鼠检测 ２．３．１ 鼠尾基因组ＤＮＡ ＰＣＲ检测结果：鼠尾基因 组ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后，通过ｌ％琼脂糖凝胶电泳， 阴性、阳性和空白对照成立，阳性小鼠在２４７ｂｐ处可 见扩增条带。部分结果见图２。 ２．３．２鼠尾基因组ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测结果：４只 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国比较医学杂志2008年7月第18卷第7期ChinJCompMed，July2008V0118N07，．．．3M+一N12345673讨论随着功能基因组研究的发展从生物整体水平，进行基因功能研究是目前发展的趋势因此各种人，，类疾病转基因动物模型不断建立已经为许多疾病，的发病机制研究提供了十分有用的材料图2Fig．。利用转基因技术建立人类疾病动物模型比其他方法更有优鼠尾DNA2ResuPCR检测结果c势它可以在动物原来遗传背景的基因上通过改变，，hofPCRprodur，toftra一nsgenicmice，某种基因的表达水平而实现N。”。。注：M：DL2000Marke+：阳性对照，，：空白对照：正常BDFI小鼠No，I24、、、7：转基因阳性鼠r．356、、：转基因阴性鼠l：p转基因小鼠模型在许多基础生物科学研究中起到重要作用，te：M：DL2000Markegativecon+：positilvecontroEGFPtn—ni2plasmidgenicm。；：由转基因小鼠体系发展而建立的反求一control：N—：netroel，normamouse，I、2、4、7：transice；3、遗传学就是先在体外使基因某，片段产生突变然，56、：nontransgenicmic．后将其导人基因组从而研究基因功能与结构的关nPCR检测阳性的tni2转基因小鼠)。Southern检测均rn系tnn№。本实验就是根据文献报道构建了TNNl2，pEGFP．有特异目的条带(图，35、12，、19、23号Southe检i2，基因第175个氨基酸缺失采用显微注pEGFPtnni2—测阳性可见特异整合条带正常小鼠基因组DNA射法把外源基因，注射入BDFl小鼠受。未见特异条带精卵产生了转。TNNl2，突变基因的转基因小鼠并且、通过RT—PCR检测该基因在转基因鼠的肌肉心脏有表达。远端关节弯曲是，一种先天性多发性关节挛缩畸2形遗传病主要表现为，个或2个以上关节的挛缩9畸形和其他关节弯曲的不同之处在于、型DA都Zhu共同表现出不同程度的手足以及多个关节的挛缩畸形长图3rig．。与该疾病相关的cTNNl2基因是1994，年DNA等从人类骨骼肌548bp，DNA文库中克隆得到的，c全编码182个氨基酸定位于I亚1lpl5。TNNl2，鼠尾DNA3：sou￡}lethembloblott检测结果o编码快反应骨骼肌肌钙蛋白的icm基(troponinITnI)Resultofsounrf一tm：nsgenice注：+阳性对照PCR扩增产物．；正常小鼠DNA；5、12、19、23此蛋白与小鼠的TnI在氨基酸一级结构上有，97％的PCRNo23检测转基因阳性鼠：DNAt；一同源性：。TnI与，CT、两个亚基共同构成Tn通过结ATPte：+PositiveecontromlisPCRproducicebyPCRNormalmou~；5、12、19合肌动蛋白(acTn抑制肌钙肌凝蛋白。酶：PositivtransgenictomyosinATPa)的功能Su一ng。等发现TNNl2的突DA2B233．．转基因小鼠不同组织tnnRTPCR．检测结果：RT变是导致的家庭中DA2BTNNl2的原因之”0在中国患有PCR结果显示i2mRNA在肌肉心脏表达(图、4)基因的第175个氨基酸缺失是导致。。该病的重要原因(第t．．．．．．．．—本研究得到的转TNNl2，突变基因175个氨基酸缺失)的转基因小鼠将对研究。nni~—DA2Bp~的发病机理奠定基础：ain参考文献[1]HallJG，ReedSDo，GreeneGan．Thedistalart}Im铲yposes：edlineationne图4mn／2RTPCR检测结果resufnewentltiesreview—d．nosologicdiscussion[J】．AmJMedGet，1982，11№m4Electrophoretielt(2)：185，239ofRTPCRproductoftransgenie[2jKrakowiakPAfreeman0s’icesQuinnmeJRma，BohrlsacktoJF一．，eta1．Avd．aIlt0fheldon，注：1Note．肾；2．．肌肉；3．．4心脏；yndro．肝t：45；．．肺．ps．llpl55pier[J]AmJHumGenet，199760，：1kidney；2(2)：426，—432．muscle3；．hear1iver；51ung【3JnJiangMZhaoXLHuWTaetaI．AesenovddeIetioninTNNl2mc丑usesdistalarthrosryposisin1a增eChinfailywithmarkedvariability维普资讯 http://www.cqvip.com ４ 中国比较医学杂志２００８年７，Ｅｌ第１８卷第７期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ，Ｊｕｌｙ ２００８，Ｖｏ１１８．Ｎ０．７ ．《中国比较医学杂志》被国家科技部“中国科技论文统计源期刊＂ 【中国科技核心期刊）收录 《中国比较医学杂志》（原名《中国实验动物学杂志》，１９９１年创刊）是由中国实验动物学会主办的国家级 科技期刊。２００３年正式更名为《中国比较医学杂志》。 比较医学是对不同种动物（包括人）之健康和疾病状态进行类比研究的科学。在生命科学研究中起着 十分重要的作用。比较医学真正形成一门的新兴学科是在２０世纪５０年代初，他是随着实验动物科学 诞生而同时发展起来的。特别是在２０世纪８０年代初，美国首先兴起比较医学，在２０多个医学院校中建立 了比较医学系，使分散的各分科动物实验集中于比较医学这一新的学科中，发挥边缘学科杂交优势，使病原 （病因）在很不相同的宿主身上引起的各式各种反应和发展过程综合成全息图像，这可能是对疾病的最透彻 的了解，也充分发挥了比较医学在生命科学前沿的尖兵作用。 比较医学的兴起与发展，标志着实验动物科学不仅是生命科学研究的重要支撑条件，而且是生命科学 的重要前沿学科。为了更好地与国际接轨，我刊自２００３年正式更名以来，受到广大作用和读者的厚爱。经 同行专家评议及学术指标综合评定，被国家科技部“中国科技论文统计源期刊”（中国科技核心期刊）、《中国 生物学文摘》和“中国生物学文献数据”、“中文生物医学期刊文献数据库一ｃＭｃｃ”、“中国生物医学期刊引文 数据库一ｃＭｃＩ”、“中国核心期刊（遴选）数据库”、“中国基础科学期刊文献总库”、“中国医院知识仓库”、“中 国农业知识仓库”和“中国城市规划知识仓库”等收录。欢迎从事生命科学研究的广大科技工作者一如既往 地关爱我刊，共同为我国的比较医学科学发展做出贡献！
