８２４ 中国抗生素杂志２０１ ８年７月第４３卷第７期 文章编号：１００１—８６８９（２０１８）０７－０８２４—０７ 多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化 扶教龙徐敏强 张松张瀚鞠鑫姚雪梅胡翠英李良智 ｆ苏州科技大学，化学生物与材料工程学院，苏州２１５００９） 摘要：目的 利用诱变结合抗性筛选方法选育多杀菌素高产菌株，并通过发酵培养基优化进一步提高多杀菌素产量。方 法 分别确定链霉素、安普霉素和鼠李糖３种抗性的最小抑菌浓度（ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ），然后以Ｓ．ｓ１—４为出发菌 株，通过紫外（ｕｖ１结合链霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子诱变选育，在此基础上利用亚硝基胍（ＮＴＧ）结合上述抗性因子诱变 选育，并利用响应面实验设计对发酵培养基中葡萄糖、糊精、棉籽蛋白３种成分进行优化。结果 出发菌株经过紫外照射３０ｓ， 涂布于抗性平板上，筛选得Ｎｓ．ｓ２．２１，ｓ．ｓ２．２１再用ＮＴＧ处理３０ｍｉｎ，涂布于抗性平板上，最终获得１株遗传性状稳定的菌株Ｓ．ｓ３． ３７，产量为７８．２６ｍｇ／Ｌ，提高了４５．７１％；发酵培养基优化后，其产量达８３．００ｍｇ／Ｌ。结论 利用紫外和ＮＴＧ结合抗性复合诱变选 育获得多杀菌素高产菌株是有效的，通过发酵培养基优化，其产量较出发菌株提高了５４．５５％，获得良好的效果。 关键词：多杀菌素；刺糖多孢菌；抗性筛选；复合诱变育种；培养基优化 中图分类号：Ｒ９７８．１ ５ 文献标志码：Ａ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ Ｆｕ Ｊｉａｏ－ｌｏｎｇ，Ｘｕ Ｍｉｎ—ｑｉａｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｓｏｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｈａｎ，Ｊｕ Ｘｉｎ，Ｙａｏ Ｘｕｅ—ｍｅｉ，Ｈｕ Ｃｕｉ—ｙｉｎｇ ａｎｄ Ｌｉ Ｌｉａｎｇ—ｚｈｉ （Ｓｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｎｄ ａＭａｔｅｒｉａｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｕｚｈｏｕ ２ １ ５００９） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｂｒｅｅｄ ｈｉｇｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，ａｐｒａｍｙｃｉｎ，ａｎｄ ｒｈａｍｎｏｓｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｂｙ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ＵＶ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，ａｐｒａｍｙｃｉｎ，ａｎｄ ｒｈａｍｎｏｓｅ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ａｎｄ Ｓ．ｓ ｌ－ ４ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ．Ｏｎ ｔｈｉｓ ｂａｓｉｓ，ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＮＴＧ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｄｅｘｔｒｉｎ，ａｎｄ ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ ｒｔｅａｔｅｄ ｂｙ ＵＶ ｆｏｒ ３０ｓ ｗｅｒｅ ｓｐｒｅａｄ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｔｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｓ．ｓ２—２１ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ Ｓ．ｓ２—２１ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｒｔｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＮＴＧ ｆｏｒ ３０ｍｉｎ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｔｅ．Ｏｎｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ Ｓ．ｓ３．３７ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｔ ｌａｓｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｄ ７８．２６ｍｇ／Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ４５．７１％．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ ８３．００ｍｇ／Ｌ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＶ ａｎｄ ＮＴＧ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｇｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｒａｉｔｎ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ ｗａｓ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ．Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ５４．５５％ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｓｕｌｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎｏｓａｄ；Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ；Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｍｅｄｉｕｍ 收稿日期：２０１７．０８．２９ 基金项目：苏州市科技计划项目（Ｎｏ．ＳＮＧ２０１７０５３）；国家自然科学基金项目（Ｎｏ．２１３７６１５６）；苏州科技学院科研基金项目（Ｎｏ．ＸＫＺ２０１４１１、 作者简介：扶教龙，男，生于１９６９年，副教授，主要从事生物化工、微生物育种，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｌｆｕ９９９＠１２６．ｃｏｍ 多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化扶教龙等 多杀菌素（Ｓ Ｐ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ ｄ）是由刺糖多孢菌 （Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）经次级代谢产生的一种大 单因素和响应面实验来确定刺糖多孢菌发酵生产的 最优培养基。 环内酯类生物杀虫剂，其主要活性成分为Ａ（ｓｐｉｎｏｓｙｎ Ａ）和Ｄ（ｓｐｉｎｏｓｙｎ Ｄ），分别约占８５％和１５％ｔ”。多杀菌 １材料与方法 １．１材料 １＿１．１菌株 刺糖多孢菌ＡＴＣＣ４９４６０（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）：购于中国普通微生物菌种保藏管理中心 （ＣＧＭＣＣ）。 素杀虫谱广，对人、非靶标动物和环境极为安全， 可生物降解【ｚ］，并且用药量少，持效期长，当浓度为 １ｍｇ／Ｌ时能保护谷物至少４个月［ 。多杀菌素可用于 防治蔬菜、水果等农作物害虫［４］。近几年来，生物农 药产量每年以１Ｏ％～２０％的速度递增，销售额增长迅 速，多杀菌素作为高效、环境友好型的生物农药具有 广阔的市场前景［５］。我国是农业大国，需要大量杀虫 剂，年销售额达２００多亿人民币。目前，该产品为美 国陶氏益农公司独家生产，国内多杀菌素的研究还处 于实验室阶段［ 】。因此，选育优良的多杀菌素生产菌 株及优化培养基来提高其产量具有重要的研究意义。 刺糖多孢菌高产菌株的选育主要包括物理诱变 和化学诱变法，此外基因组重排、基因工程菌构建 等方法也能得到高产菌株。传统诱变方法紫外诱变 及亚硝基胍诱变仍为有效的方法。Ｗａｎｇ等【７】将转氢 酶基因导入亲本菌株中进行验证，结果表明摇瓶实 验中多杀菌素产量从４０．３９ｍｇ／Ｌ提高到Ｔ７５．３２ｍｇ／Ｌ。 Ａｍｉｔ等【 ］通过构建基因工程菌，表达ｍｅｔＫ１、ｒｍｂＡ和 ｒｍｂＢ基因，经过紫外诱变，最终多杀菌素Ａ和Ｄ分 别达￣１Ｊ３７２和２１７ｍｇ／Ｌ，是野生型菌株的７．４４和８．Ｏ３ 倍。陈园等【 】通过亚硝基胍诱变，并利用高通量筛选 方法进行刺糖多孢菌诱变选育，获得８株高产菌株， 其中１株比出发菌株提高了４３．９４％。Ｌｉａｎｇ等［１０】通过 鼠李糖和丙酸钠抗性筛选策略加上紫外辐射，获得 的诱变菌株多杀菌素产量达１２５．３ｍｇ／Ｌ，较野生菌株 提高了２８５．５％。为了使诱变菌株能在适宜的条件下 生产稳定，对其发酵培养基的优化必不可少。赵晨 等【 】通过响应面方法优化刺糖多孢菌发酵培养基， 其产量达到１８０．６ｍｇ／Ｌ，较优化前提高了５６．８７％。潘 明丰等【－：］通过响应面分析试验优化发酵培养基，获 得的多杀菌素产量为５４４．６０ｇ／Ｌ，较优化前产量提高 了２４．４８％。Ｙａｎｇ等［１３］通过对发酵培养基进行优化， 多杀菌素产量从初始的（３１０．４４￣２１．８４）ｐｇ／ｍＬ提高到 （５４９．８９￣３８．５９）￣ｇ／ｍＬ。可见，通过培养基优化来提高 发酵产物效价，是发酵工艺研究中一个重要的手段。 本文以自然筛选菌株为出发菌株，先后通过紫 外和亚硝基胍两次诱变并首次结合链霉素、安普霉 素、鼠李糖３种抗性来选育多杀菌素高产菌株。采用 １．１．２试剂 酵母提取物、牛肉提取物、ＮＺ ａｍｉｎｅ ｔｙｐｅ Ａ、 葡萄糖、琼脂、淀粉、黄豆饼粉、棉籽蛋白、大 豆蛋白胨、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸亚 铁、碳酸钙、糊精、鼠李糖、安普霉素、链霉素、 色谱甲醇、色谱乙腈、色谱乙酸铵、丙酮、亚硝基 胍、１００ｍｇ／ｍＬ多杀菌素标准品。 １．１．３培养基 平板和斜面培养基（ｇ／Ｌ）：酵母提取物１、牛肉提 取物１、ＮＺ ａｍｉｎｅ ｔｙｐｅ Ａ ２、葡萄糖１Ｏ、琼脂２０，ｐＨ 用ＮａＯＨ调至７＿３，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。 种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１５、淀粉１０、黄豆饼 粉３、棉籽蛋白３、大豆蛋白胨２５、ＭｇＳＯ４＂７Ｈ．Ｏ ２， ｐＨ用ＮａＯＨ调至７．２，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。 发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５Ｏ、糊精２０、棉籽蛋 白２０、ＮａＣ１ ３、Ｋ２ＨＰＯ４＂３Ｈ２Ｏ １、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．０５、 ＣａＣＯ １，ｐＨ用ＮａＯＨ调至７．２，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。 １．１．４仪器设备 高效液相色谱仪、灭菌烘箱、超净工作台、恒 温摇床、恒温培养箱、离心机、漩涡混合器、超声 波破碎仪，磁力搅拌器。 １．２培养方法 １．２．１菌种活化 将甘保存的刺糖多孢菌稀释涂布到平板培养 基上，２８℃条件下恒温培养７ｄ，待菌落生长成熟。 挑取平板上的单菌落划线接种于斜面培养基 上，２８￣Ｃ条件下恒温培养７ｄ，待菌落生长成熟。 １．２．２种子培养 挑取斜面上的白色孢子接入种子培养基中， ２８℃条件下２２０ｒ／ｍｉｎ振荡培养７２ｈ。 １．２－３发酵培养 取１０％（ ｎ种子培养液移入发酵培养基中， ２８℃条件下２２０ｒ／ｍｉｎ振荡培养７ｄ。 １．３多杀菌素含量测定 ８２６ 中国抗生素杂志２０１８年７月第４３卷第７期 取２ｍＬ发酵液，记为 ，加入２ｍＬ甲醇，用漩 涡混合器充分摇匀，超声１５ｍｉｎ，静置提取１２ｈ， 准液的峰面积。以峰面积为纵坐标，多杀菌素浓 Ｙ＝ＩＯ．８６４Ｘ－１６．９０９，线性相关系数为０．９９２６，这说明 多杀菌素在５～１００ｍｇ／Ｌ范围内线性关系较好。 度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为 ５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，精确测量上清液体积，记 为ｖ ，上清液过滤后进行ＨＰＬＣ分析。色谱条件： 色谱柱：ＸＤＢ—Ｃ 反相柱；流动相：甲醇：乙腈： 水＝４５：４５：１０（ ，含０．０５％乙酸铵；进样量： ２．２ 抗性平板中链霉素、安普霉素和鼠李糖浓度的 确定 ２０ｇＬ；流速：ｌｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：２５０ｎｍ；柱温： 室温。根据多杀菌素标准曲线以及多杀菌素Ａ和Ｄ组 分的积分面积，计算发酵液中多杀菌素含量，记为 利用药物抗性突变技术处理菌株可能获得产新 结构物质的菌株。菌株通过获得链霉素的抗性突 变，自身的核糖体结构和次级代谢活动会发生一些 ｍｌ。，￣Ｊｌｍ０＝Ｆ２／ＶＩ￣ｍ１。 上式中 为发酵液中多杀菌素含量（ｍｇ／Ｌ），ｍ 为测得的多杀菌素浓度（ｍｇ／Ｌ）， 为吸取的发酵液体 积（ｍＬ）， 为离心后上清液体积（ｍＬ）。 １．４实验方法 １．４．１孢子悬液的制备 取一支培养成熟的新鲜斜面，加入５ｍＬ无菌水， 用灭菌竹签将白色孢子轻轻刮下，转移到玻璃珠小瓶 中，震荡打散孢子，经８层纱布过滤后即得孢子悬液。 １．４．２抗性筛选 将孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素、 安普霉素、鼠李糖和空白的平板培养基中，２８℃条 件下恒温培养７ｄ，观察菌落生长情况。 １．４．３ 紫外诱变 以自然筛选产量为５３．７ｌｍｇ／Ｌ的Ｓ．Ｓ１—４为出发菌 株，参考文献［１ｏ１的方法进行紫外诱变，涂布于抗性 平板上，挑取单菌落，试管保存以备筛选。 １．４．４亚硝基胍诱变 在紫外诱变的基础上，参考文献［９］的方法进行 ＮＴＧ诱变，涂布于抗性平板上，挑取单菌落，试管 保存以备筛选。 １．４．５单因素实验 单因素法考察葡萄糖浓度４０、５０、６０、７０、８０ ｇ／Ｌ、 糊精浓度１０、２０、３０、４０４￣Ｕ５０ｇ／Ｌ、棉籽蛋白浓度 ｌ５、２０、２５、３０￣１］３５ｇ／Ｌ对多杀菌素产量的影响。 １．４．６ 响应面优化方法 根据单因素结果，以多杀菌素产量为响应值， 采用Ｂｏｘ．Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合试验设计３因素３水平响应 面分析表及验证试验，最终确定发酵培养基的最佳 配方。 ２结果与分析 ２．１多杀菌素标准曲线 利用高效液相色谱仪测得不同浓度多杀菌素标 改变，进而导致相关目标代谢产物产量有较大的提 升 ］。安普霉素与其他氨基糖苷类抗生素不产生交 叉耐药性，即对某些氨基糖苷类抗生素的耐药性仍 有较强的抑制作用【¨］。在多杀菌素的生物合成中， 鼠李糖可作为其合成的前体，也可作为合成刺糖多 孢菌细胞壁的重要物质［１６１。 如表１所示，当链霉素、安普霉素和鼠李糖浓度 生鼠生 长李长 分别低于２０、３和１．５ｇ／Ｌ时，菌株长势正常，孢子量 状糖状 况浓况 大，而当浓度大于上述添加量时，平板中菌株受到 度 抑制，菌落数明显减少，当浓度分别达￣ｌＪ４０ｍｇ／Ｕ Ｌ、 ７ｍｇ／Ｌ￣Ｈ３ｇ／Ｌ时菌株几乎无法生长，故将其作为最小 抑菌浓度。 表１各抗性物质对剌糖多孢菌的生长影响 一Ｔａｂ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｈ 一ｏｎ ｇｒｏｗｔ 一 ｈ ｏｆ ＋ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ Ｌ． １ ｝ 链霉素浓度／（ｍｇ／Ｌ１ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ５ ６０ ＋ 生长状况 ＋抖＋抖 ＋ 一 一 ． 一 ＋ 安普霉素浓度／（ｍｇ／Ｌ）１ ３ ５ ７ ９ １１ 一 ＋ ２．３紫外诱变 紫外光照射能引起微生物ＤＮＡ结构的变化，不 同强度紫外光会导致不同的致死率＿】７］。孢子悬液经 过紫外照射后进行适当稀释，涂布于链霉素、安普 霉素和鼠李糖浓度分别为４０ｍｇ／Ｌ，７ｍｇ／Ｌ￣ｌ：ｌ３ｇ／Ｌ的 平板上，用黑纸包裹住，防止光复活作用。挑取５０ 株长势良好的单菌落进行摇瓶复筛，测定多杀菌素 产量，筛选结果如图１所示，有１５株突变株多杀菌素 的产量有所提高，正突变率为３０％。其中ｓ．ｓ２—２１多 杀菌素产量最高，达６１．９５ｍｇ／Ｌ，较原始菌株提高了 １５．３４％，诱变效果较好。 如图２一ａ所示，随着紫外光照射时间的不断增 加，菌种的致死率随之增大。在本实验中，当紫外 多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化ｒ，，ｒ●●ｒ，● 扶教龙等 ６５ ６。▲■■■■。■■■■。■■■■■．■■■Ｌ ＿ｔ■．■■■■■■■■■■■■■■■■。■■。■■■Ｌ ５ ．ａ 一．ｔ＿１．－＿。＿．－．－－Ｌ ／ ｒ ５ ．Ｔ■■■■■■■■■■■＿＿Ｌ 一．ｔ■■■■■■■■■■■■■＿■■■■■■■■■■■■■Ｌ＿＿■Ｌ ｂ 一 懈４０ ３５ ３０ １ １ ６ 一一．ｔ。． 。。。．．．．。．．．．．．．。．．．．Ｌ．。ｔ■■■．■■■■■．■■．■－ｒ．ｔ■■■■■．＿■■■■●Ｊ■■■■■．■■■。●Ｌ ■■■■■■■■■＿＿Ｌ Ｔ■．■■■■■■■■■■■■■■。■■■■．■■Ｌ 一．ｔ．＿．＿＿＿＿．＿＿＿Ｌ ～Ｔ■■■■■■■■■■。■Ｌ …… ５ ９ ．１３ １７ ２Ｉ ２５ ２９ ３３ ３７ ４１ ４５ ４９ １ ５ ９ １３ ｌ ７ ２Ｉ ２５ ２９ ３３ ３７ ４１ ４５ ４９ 图１ 紫外诱变筛选结果 Ｔ．Ｔ■■■■■■■■■■■■■Ｌ 一．ｔ－ｌＩＩ－＿＿ｌ＿ｌ１．ＩＬＴ。Ｔ■■■■■■■■■■＿Ｌ Ｆｉｇ．１ 一。ｔＩＬ＿＿＿ｌ＿＿＿Ｓｃｒｅｅｎｉ＿＿＿ｌ＿，Ｉ＿＿＿．＿。．Ｌｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＵＶ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ．．图３ Ｉ 硝丛胍诱 筛选 果 Ｆｉｇ．３ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＮＴＧ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ‘．。。－－－－＿＿＿＿＿．＿＿＿＿Ｌ ●●■■■■■■■工 ｌ００ ８０ 一■－■■■■■■■■■■■■●■■■．■。■Ｌ一．ｔ＿＿。Ｉ．Ｉ．Ｔ‘Ｔ■。＿■－■■■＿－■。Ｌ＿＿＿－＿。ｌ－＿－＿＿＿＿Ｌ ，。＋＿＿＿Ｌ 所以本实验采用亚硝基胍诱变时间为３０ｍｉｎ。 如图４所示，原始菌株呈凸起型，表面较光滑。 经过复合诱变后菌株呈凹陷型，菌落表丽有褶皱。 摹 毒６０ ～ Ｔ．ｒ■■■■■■■■■■■■■■■Ｌｔ．ｔ－－．＿ｌＬ 誊４０ ２０ 一●ｔ＿ｌｆ●Ｉ●＿Ｉ＿－＿＿＿ＴＬ＿＿＿＿＿＿ＬＩＬ ２．５遗传稳定性结果 由于突变体在传代中可能出现表型延迟现象， ０ ０ 一１／暑ｕＩ一＼＿直 搦坦 诱变ｎＣ Ｊ＇￣／ｓ １０ ２Ｏ ３０ ４０ ５Ｏ ６Ｏ 导致筛选到的高产菌株经传代后发酵产量降低。囚 此，对筛选到的３７号高产突变株进行了遗传稳定性 验证，分别经过２、４和６次转接传代后，多杀菌素 产量分别为７６．１４、７５．４ｌ和７５．１ ８ｍｇ／Ｌ，分别降低了 ２．７％、３．６％和３．９％，但总体变化幅度在５％以内，表 舳 ∞如∞如 ｌ００ ８Ｏ 装 蒜６０ 鑫 ４０ ２０ ０ 明该突变株遗传较稳定。 ２．６发酵培养基优化 ０ ｌＯ ２０ ３０ ４Ｏ ５０ ６０ 诱变ｌＩ’『问，ｓ ２．６．１ 葡萄糖对多杀菌素产量的影响 从图５可以看出，当葡萄糖浓度达￣ｆｊ５Ｏｇ／Ｌ时， 多杀菌素产量达到最大，为７４．３５ｍｇ／Ｌ；当葡萄糖浓 度继续增大时，多杀菌素产量呈下降趋势，可能由 图２诱变致死率曲线 Ｆｉｇ．２ Ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ 照射时间为３０ｓ时，致死率达￣ＴＪ８０．５８％，当照射时间 为６０ｓ后，其致死率几乎达到】００％，所以本实验采用 紫外线照射诱变剂量为３０ｓ。 ２．４亚硝基胍诱变 于葡萄糖浓度过高引起“葡萄糖效应”，影响菌体 生长和代谢产物的形成。因此，确定本实验葡萄糖 浓度为５０ｇ／Ｌ。 ２．６．２糊精对多杀菌素产量的影响 从图６可以看出，当糊精浓度低于２０ｇ／Ｌｉｔ，Ｊ，多 ＮＴＧ是应用广泛的化学诱变剂之一，细胞经ＮＴＧ 处理，可诱发ＧＣ．ＡＴ的转换，另外还可诱发ＤＮＡ小 范围切除、移码突变及ＧＣ对缺失的突变发生 １。将 紫外诱变结合抗性筛选获得的Ｓ．ｓ２—２１菌株进行ＮＴＧ 诱变，然后将其涂布于链霉素、安普霉素和鼠李糖 浓度分别为４０ｍｇ／Ｌ，７ｍｇ／Ｌ和３ｇ／Ｌ的平板上。培养 成熟后，从平板上挑取５０株长势良好的单菌落进行 摇瓶复筛，测定多杀菌素产量，筛选结果如图３所示， 杀菌素产量不断增大；当糊精浓度达￣ｉ］２０ｇ／ＬＨ￣，多 杀菌素产量达到最大，产量为７６．２０ｍｇ／Ｌ：当糊精浓 有１ ３株突变株多杀菌素的产量有所提高，正突变率 为２６％。其中Ｓ．ｓ３．３７号突变株多杀菌素产量最高，达 ７８．２６ｍｇ／Ｌ，较ｓ．ｓ２—２ｌ提高了２６．３２％，诱变效果较好。 如图２一ｂ所示，随着诱变时间的增加，菌株的致 死率也逐渐上升。当诱变时间为６０ｍｉｎ时，致死率为 ９９．８ｌ％。当诱变时间为３０ｍｉｎ时，致死率为７９．２５％， ａ原始菌株 ｂ突变 株 图４原始菌株 突变菌株形态比较 Ｆｉｇ．４ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ ８２８ 中国抗生素杂志２０１ ８年７）ｑ第４３卷第７期 ７６ ７５ ７４ ∞ ７３ 删Ⅲｌｌ ７２ ７１ ７０ ６９ ６８ ４０ ５０ ６０ ７０ ８Ｏ 葡萄糖浓度／（ｇｉｎ） 图５葡萄糖浓度对多杀菌素产量的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ 一 ∞邑＼ｒ軎 帐粗 ∞ 吕 加 七Ｌ 懈 ｛匾 １Ｏ １５ ２０ ２５ ３０ 糊精浓度／（ｇｉｎ） 图６糊精浓度对多杀菌素产量的影响 Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｘｔｒｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ 度继续增加时，多杀菌素产量反而下降。因此，糊 精浓度确定为２０ｇ／Ｌ。 ２．６．３棉籽蛋白对多杀菌素产量的影响 从图７可以看出，当棉籽蛋白浓度低于２０ｇ／Ｌ 时，多杀菌素产量随棉籽蛋白浓度升高而增加；在 ２０ｇ／Ｌ时达到最大值７５．２０ｍｇ／Ｌ；当棉籽蛋白浓度高于 ２０ｇ／Ｌ时，多杀菌素产量逐渐下降。因此，确定棉籽 蛋白浓度为２０ｇ／Ｌ。 ２．７响应面优化 ２．７．１模型的建立及显著性检验 根据单因素实验的结果，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ实验 设计，对葡萄糖、糊精、棉籽蛋白３个因素进行响应 面实验优化，结果见表２。 用Ｄｅｓｉｇｎ—Ｅｘｐｅｒｔ Ｖ８．０．６软件，对表进行多元回 归拟合，得到多杀菌素产量（】，）对葡萄糖、糊精、棉 籽蛋白的回归方程：Ｙ＝８０．９５＋３．６３Ａ＋４．２１Ｂ＋５．４２Ｃ． ＂ 仍 加 铝 １５ ２０ ２５ ３０ ３５ 棉籽蛋白浓度／（ｅ，／Ｌ） 图７棉籽蛋白浓度对多杀菌素产．量的影响 Ｆｉｇ．７ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ 表２响应面实验设计及结果 Ｔａｂ．２ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ １ ０ ０ ０ ８１＿３８０ ２ —１ ０ １ ５７．９３７ ３ ０ ０ ０ ８０．８２２ ４ ０ —１ １ ７０．２４３ ５ ０ —１ —１ ５１．５７８ ６ —１ １ Ｏ ６８．５５６ ７ １ 一ｌ ０ ６６．６４５ ８ —１ —１ Ｏ ５６．５０１ ９ ．１ ０ １ ６２．７６２ １０ ０ ０ ０ ８０．６６ｌ １１ ０ １ １ ７１．３２０ １２ １ ０ —１ ６０．４４９ １３ １ １ ０ ７３．６７１ １４ ｌ Ｏ １ ７４．０５１ １５ ０ １ ．１ ６５．Ｏ８１ 注：Ａ：葡萄糖；Ｂ：糊精；ｃ：棉籽蛋白；Ｙ：产量 １．２６ＡＢ＋２．１９ＡＣ－３．１１ＢＣ－７．６８Ａ２＿６．９３Ｂ２－９．４７Ｃ２。对实 验结果进行显著性检验及方差分析，结果见表３。 由表３可知，方差模型显著性Ｐ＜０．０００１，表 明该方程拟合度较好；同时失拟项Ｐ值为０．０５０８＞ ０．０５，说明模型失拟不显著，残差由随机误差引起， 模型有效；该方程决定系数Ｒ２＝Ｏ．９９３０，说明该模型 能较好地预测发酵培养基组分与多杀菌素产量的关 系；校正决定系数Ｒｚ ＝０．９８０３，表明方程模型可信 度较高，能够较好地描述试验结果。 ２．７．２响应面优化及分析 根据Ｂｏｘ．Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计结果作出三维响应 多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化表３回归模型方差分析 扶教龙等 ８２９ Ｔａｂ．３ Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ Ｅ 善 坦 ｂ 一１／∞ｇ一＼ｒ軎 翘 （ 面，如图８所示，分别反映了葡萄糖浓度（ ）、糊精浓 度（ ）、棉籽蛋白浓度（Ｃ）这３个因素的两两交互作用 ． 对产量的影响。 Ｅ 耐 葡萄糖和糊精对多杀菌素产量的影响如图８－ａ所 示，当葡萄糖浓度一定时，多杀菌素产量随着糊精 浓度增加而增大，但当糊精浓度大于１５．５ｐｄＬ时，多杀 菌素产量呈下降趋势。当糊精浓度一定时，随着葡萄 糖浓度的增加，多杀菌素产量也随之增大，但当葡萄 糖浓度继续增大时，多杀菌素产量逐渐降低。 棉籽蛋白和葡萄糖及棉籽蛋白和糊精对多杀菌素 产量的影响如图８＿ｂ和图８．Ｃ所示，其规律与图８＿ａ相同。 ２．７．３优化培养基的验证 根据所得的模型，由响应面分析法求得优化后３ ：随 图８葡萄糖、糊精和棉籽蛋白浓度交互作用对多杀 素产氢 影响的响心而和等高线 Ｆｉｇ．８ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌｏｔｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｏｕｒ ｌｉｎｅ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｄｅｘｔｒｉｎ ａｎｄ ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓａｄ 种成分的最佳浓度为：葡萄糖５４．３ｇ／Ｌ、糊精１５．５ｇ／Ｌ、 棉籽蛋白２５．７ｇ／Ｌ，预测得到多杀菌素最高产量为 ８２．６４ｍｇ／Ｌ。为了验证实验结果的可靠性，按上述最 终培养基参数进行验证实验，３次重复实验的多杀菌 株Ｓ．ｓ３．３７，其多杀菌素产量为７８．２６ｍｇ／Ｌ，遗传稳定 性良好，比自然筛选菌株提高了４５．７％。在单因素 实验的基础上，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计，对其 发酵培养基进行了优化。最终得到优化的培养基为 素产量的平均值为８３．００ｍｇ／Ｌ，与预测值接近，表明 模型是可行有效的，具有一定的实践价值。 ３结论 （ｇ／Ｌ）：葡萄糖５４．３，糊精ｌ５．５，棉籽蛋白２５．７，ＮａＣ１ ３，Ｋ２ＨＰＯ４＂３Ｈ２Ｏ ｌ，ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．０５，ＣａＣＯ３ ｌ。在 本实验采用紫外诱变结合链霉素、安普霉素及 此条件下，测得多杀菌素产量为８３．ＯＯｍｇ／Ｌ，与预测 值８２．６４ｍｇ／Ｌ￣Ｈ差不大。因此，采用响应面法优化刺 鼠李糖３种抗性的育种方法，将筛选获得的Ｓ．ｓ２—２ｌ进 行亚硝基胍诱变结合抗性筛选，通过紫外和亚硝基 胍复合诱变选育，最终筛选获得ｌ株多杀菌素高产菌 糖多孢菌发酵培养基组成稳定可行。综上所述，复 合诱变育种方法和响应面法优化培养基为后续进一 ８３０ 中国抗生素杂志２０１８年７月第４３卷第７期 ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ Ａ ａｎｄ Ｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ，２０１４，３７（１０）：７２７－３３． 步深入研究打下了良好的基础，同时，也可为其他 菌种的选育提供一定参考价值。 参考文献 『１］ 盛志，陈凯，李旭．多杀菌素生物合成的研究进展［Ｊ］．微生 物学报，２０１６，５６ｆ３１：３９７．４０５． 『９］ 陈园，熊犍，郭伟群，等．多杀菌素产生菌的高通量诱变选 育［Ｊ］．中国抗生素杂志，２０１３，３８（５）：３３９—３４３． ［１０］Ｌｉａｎｇ Ｙ’Ｌｕ Ｗｅｎ Ｊ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ ａｎｄ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｓｐｉｎｏｓａｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，１５２（３）：４４０—４４８． 『２１ 蔡恒，王燕，万红贵，等．刺糖多孢菌生产多杀菌素的研究 进展［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１１，３１（２）：１２４—１２９． 【３】 Ｖａｙｉａｓ Ｂ Ｊ，Ａｔｈａｎａｓｓｉｏｕ Ｃ Ｇ，Ｍｉｌｏｎａｓ Ｄ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｆｓｐｉｎｏｓａｄ ｏｎ ｗｈｅａｔ，ｍａｉｚｅ ａｎｄ ｂａｒｌｅｙ ｇｒａｉｎｓ 『１１］赵晨，叶丽娟．利用响应面方法优化多杀菌素发酵培养基 ［Ｊ］．中国抗生素杂志，２０１０，３５（１２）：９４５．９５０． ｆ１２１潘明丰，郭美锦，储炬，等．多杀菌素种子培养基及发酵培 ａｇａｉｎｓｔ ｆｏｕｒ ｍａｊｏｒ ｓｔｏｒｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｅｓｔｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔ， ２０１０，２９（５）：４９６—５０５． 『４１ 罗莉斯，李能威，李丽，等．９６孔板高通量筛选多杀菌素高产 菌株的研究［Ｊ］．中国农业科技导报，２０１０，１２（２）：１３３．１３７． 『５１ 徐玉柱．生物农药的应用现状及产业发展的建议［Ｊ］．中国 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