绿色木霉固态发酵产纤维素酶活力的研究_王仪明

PRATACULTURALSCIENCE123-1275/2009

草地畜牧业

绿色木霉固态发酵产纤维素酶　　　

活力的研究　　　

王仪明,张宗舟

1

1,2

,蔺海明,孙小弟,雷艳芳,王东明

1314

(1.甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;2.天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水741001;

3.天水师范学院工学院,甘肃天水741000;4.甘肃省科学院自动化研究所,甘肃兰州730000)

摘要:以麦秆和麸皮为主要原料,通过正交试验和单因素试验优化绿色木霉Trichdermaviride固态发酵产纤维素酶的最佳工艺条件,并研究绿色木霉对小麦秸秆纤维素降解的影响,为绿色木霉降解小麦秸秆纤维素提供最佳条件,进而提高小麦秸秆的利用率。结果表明,不同条件下绿色木霉产纤维素酶活力存在显著差异(P<0.05),最佳培养基为:氮源为(NH4)5,含水量为200%,麦秆∶麸皮质量比为4∶1;2SO4,pH值5.最佳发酵条件为:培养时间为96h、温度35℃、初始pH值6.0、含氮量0.4%、接种量15%,培养方式为半密闭;发酵后小麦秸秆中中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、纤维素含量和半纤维素含量比发酵前分别下降5.22%、6.88%、4.73%和4.16%,木质素含量无明显变化。关键词:绿色木霉;发酶条件;纤维素酶活;小麦秸秆;纤维素

中图分类号:TQ925.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2009)05-0123-05

　纤维素类物质是世界上最丰富的可再生资源[1]。纤维素材料可转化为具有商业价值的乙醇、乙酸、单细胞蛋白等纤维素的产品

[2-3]

活力较低[10]。木霉菌株是公认产纤维素酶最高的菌种之一。因此,研究绿色木霉T.viride

的培养条件及其对纤维素酶活的影响为纤维素酶的工业化生产奠定一些试验基础,为更好地利用秸秆开辟新的途径。

研究以麦秆和麸皮为主要原料,通过正交试验和单因素试验对绿色木霉固态发酵产纤维素酶的最佳培养基组分、时间、最适温度、pH值、接种量和含氮量等工艺条件进行优化,并比较发酵前后小麦秸秆的化学成分,研究绿色木霉对小麦秸秆纤维素降解的影响,为绿色木霉降解秸秆生产蛋白饲料提供最佳条件。这对提高秸秆的利用率和缓解我国高蛋白饲料严重紧缺的局面起到重要的促进作用。

[11]

。纤维

素的生物转化近些年受到了极大的重视,大规模纤维素生物转化工艺的发展,将有效解决食品和动物饲料不足的问题[4-6]。利用微生物所产生的纤维素酶将秸秆转化为营养价值较高的单细胞蛋白饲料倍受人们的青睐

[7]

。纤维素酶作为一种高

活性生物催化剂使其成为研究新型蛋白饲料开发与利用的重要内容[7-8]。纤维素酶不是一个单种酶,而是参与纤维素降解的多组分酶的总称,一个完整的纤维素酶系,通常由作用方式不同而能相互协同催化水解纤维素的3类酶组成:内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(EX)和β-葡萄糖苷酶(BG),在分解纤维素时,任何一种酶都不能单独裂解纤维素,只有3种酶共同存在并协同作用才能完成水解过程[9]。

目前,用于研究生产纤维素酶的真菌大多数属于曲霉属Aspergillus、木霉属Trichderma、青霉属Penicillum、根霉属Rhizopus等。曲霉和根霉产β-葡萄糖苷酶活性较高,而在天然纤维素降解中起重要作用的β-葡聚糖纤维二糖水解酶1　材料与方法

1.1试验材料

小麦秸秆粉(当地农户提供,粉碎过40目筛),麸皮(市售)。

＊收稿日期:2008-09-01

基金项目:国家科技支撑计划“西北内陆灌区农田循环生产

技术集成研究与示范”(2007BADB17)

作者简介:王仪明(1981-),男,甘肃天水人,硕士,研究方向

为纤维素降解及蛋白饲料生产。

通信作者:张宗舟124

PRATACULTURALSCIENCE(Vol.26.No.5)5/2009

绿色木霉由天水师范学院微生物实验室提供,保存于PDA斜面培养基。

1.1.1主要试剂　DNS试剂(3,5-二硝基水杨

酸显色液);0.05mol/LpH值4.5和pH值5.0的柠檬酸缓冲液;质量分数0.5%水杨酸苷溶液;质量分数0.51%羧甲基纤维素钠(CMC)溶液;中性洗涤剂;酸性洗涤剂。1.1.2培养基

斜面培养基:将孢子接种于斜面培养基,35℃培养,待形成一层灰绿色孢子后4℃保藏备用。

种子培养基:小麦秸秆粉10g,营养液[质量分数2%(NH4)2SO4,质量分数0.08%MgSO4·7H2O,质量分数0.04%KH2PO4]25mL。固体产酶培养基:麦秆6g,麸皮4g,营养液[2.0%(NH4)2SO4,0.08%MgSO4·7H2O,0.04%KH2PO4]25mL。

上述培养基均需在1.0×105Pa,121℃灭菌30min,pH值自然。

2　结果分析

2.1正交试验筛选绿色木霉的最佳培养基

　培养基组分对纤维素酶的形成有很大影响,方

差分析结果表明,不同培养基对绿色木霉产纤维素酶的影响存在显著差异(P<0.05)。氮源为

2SO4,含水量为200%,pH值5.(NH4)5,麦秆∶麸皮为4∶1,绿色木霉产β-葡萄糖苷酶、FPU

酶和CMC酶活力最大,分别为1.31、0.39和5.92U/mg;氮源为(NH4)3PO4,含水量为150%,pH值5.5,麦秆∶麸皮为5∶0,绿色木霉产C1酶活力最大,为1.40U/mg。通过新复极差分析发现(NH4)2SO4作为绿色木霉发酵的氮源较好(图1)。

1.2酶液的制备　取生长良好的固体发酵曲5

g,加水50mL,于30℃保温1h,用沙芯漏斗过滤,然后在转速10000r/min冷冻离心机上离心

10min,提取上清液定容至100mL,得到体积比为1∶20粗酶液。

1.3试验方法　葡萄糖酶活力采用标准曲线确

定[12];纤维素酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法);中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的测定采用范式(VanSo-est)法[14];优化培养基采用L16(44)正交设计[15],进行4因素(pH值、氮源、含水量、麦秆∶麸皮)4水平的正交试验,共16个组合(见表1);秸秆发酵前后成分的测定均采用3次重复试验。

[13]

图1　不同处理组合对纤维素酶活力的影响

2.2单因素试验优化绿色木霉的发酵条件

2.2.1培养时间对纤维素酶活力的影响　不同培养时间影响绿色木酶产纤维素酶活力,在96h绿色木霉产4种纤维素酶活力达到最大,随后下降。产C1酶活力最大为3.06U/mg,产CMC酶活力最大为2.44U/mg,产β-葡萄糖苷酶活力最大为0.39U/mg,FPU酶活力最大为0.05U/mg(图2)。2.2.2培养温度对纤维素酶活力的影响　经不同温度培养结果表明,在25℃条件下培养,酶活力随温度的升高而增大,一定温度时酶活力达到最大,在35℃产纤维素酶活力较高,随后酶活力下降。产C1酶活力最大为2.38U/mg,产CMC酶活力最大为1.97U/mg,FPU酶活力最大为0.47U/mg,产β-葡萄糖苷酶活力最大为0.32U/mg(图3)。1.4数据处理　利用Excel和SAS9.0软件做

方差分析。

表1　培养基正交试验因素和水平设计

组合1234

pH值4.55.56.57.0

氮源(NH4)2SO4(NH4)3PO4CO(NH2)2

NH4Cl

含水量150%200%250%300%

麦秆∶麸皮2∶33∶24∶15∶0

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125

2.2.4接种量对纤维素酶活力的影响　按接种量质量分数5%、10%、15%、20%、25%和30%接种于麦秆∶麸皮质量比为4∶1的固体培养基中发

酵。接种量为15%时酶活力最高(图5)。

图2　培养时间对纤维素酶活力的影响

图5　不同接种对纤维素酶活力的影响

2.2.5含氮量对纤维素酶活力的影响　改变营养液中氮的含量,在0.2%～1.6%内测定纤维素酶活力,接种后35℃培养96h,发现纤维素酶活力随含氮量的增加逐渐增大,当含氮量在0.4%酶活力较高,随后逐渐下降(图6)。

图3　培养温度对纤维素酶活力的影响

2.2.3培养基初始pH值对纤维素酶活力的影响　试验从pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5

7个水平中筛选出最适产纤维素酶的pH值。结果表明,pH值5.5时CMC酶活力最大,为5.5U/mg;pH值6.0时FPU酶、β-葡萄糖苷酶和C1酶活力最大,分别为0.42、0.32和3.51U/mg(图4)。

图6　不同含氮量对纤维素酶活力的影响

2.2.6培养方式对纤维素酶活力的影响　在氮源为(NH4)2SO4,含水量为200%,pH值为5.5,麦秆∶麸皮为4∶1,含氮量0.4%的固体基质上,在接种量为15%,温度35℃,分别选择密闭和半密闭的方式培养96h,测定纤维素酶活力。结果表明,半密闭条件下培养,营养生长旺盛,产纤维素

图4　不同pH值对纤维素酶活力的影响

酶活力较大(表2)。126

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表2　培养方式对纤维素酶活力的影响　　U/mg培养方式密闭半密闭

FPU0.310.42

β-gluase0.180.25

CMC2.133.26

C12.983.46

很大的影响,通常接种量过低产酶活性不高,并使生产周期延长。试验采用15%的接种量可缩短菌体生长达到高峰所需的时间,使纤维素酶的合

成提前。碳氮比的合理搭配对绿色木霉产纤维素酶影响较大,碳氮比低,培养初期菌体过快生长,对碳源消耗过快,碳氮比高,氮源不足导致菌体生长繁殖太慢。增加细胞通透性对提高纤维素酶活性有一定的作用,在培养基里添加表面活性剂或者采用半密封的培养方式会增加通气量,从而提高产酶量。

　注:密闭———保鲜膜封口,半密闭———麻纸封口。

2.3绿色木霉发酵对秸秆纤维素的影响　

在最佳条件下用绿色木霉发酵秸秆与未发酵的秸秆相比,发酵后秸秆的成分有不同程度的变化,NDF、ADF、纤维素和半纤维素含量分别为4.73%、4.16%、5.22%和6.88%,木质素含量无明显变化(表3)。

表3　发酵对秸秆纤维素的影响

秸秆成分纤维素　半纤维素木质素　NDF　　ADF　　

发酵前53.618.918.591.072.1

发酵后50.817.418.386.769.1

%降解率5.226.881.084.734.16

4　结论

4.1正交试验结果表明,不同培养基对绿色木霉

产纤维素酶的影响存在显著差异(P<0.05)。绿色木霉产纤维素酶的最佳培养基为:氮源为(NH4)2SO4、含水量为200%、pH值5.5、麦秆∶麸皮为4∶1。

4.2通过单因素试验确定绿色木霉产纤维素酶

的最佳发酵条件为:培养时间96h、初始pH值6.0、最适温度35℃、含氮量0.4%、接种量15%和半密闭培养方式。

3　讨论

3.1纤维素酶是一种诱导酶,在发酵过程中,纤

维素酶的大量合成必须有诱导物的作用,在培养和发酵过程中加入适当的诱导物可以增加酶的产量。麸皮富含微量生长因子或诱导物和纤维素等碳源物质,这些物质促进菌体的营养生长,比秸秆纤维素更易诱导菌种纤维素酶的产生[16]。本试验选择麦秆∶麸皮为4∶1。底物含水量的变化对微生物的生长及代谢能力有重要影响,含水量太小,物料容易因水分蒸发而变干,含水量太大,造成环境缺氧,影响菌体生长。本试验采用200%的含水量有利于菌体生长。

4.3在最佳条件下用绿色木霉发酵后与发酵前

相比,小麦秸秆的化学成分有不同程度的变化(P<0.05),其中NDF、ADF、纤维素含量和半纤维素含量分别下降5.22%、6.88%、4.73%和4.16%,木质素含量无明显变化(P>0.05)。参考文献

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pH值不一致,发酵产纤维素酶过程中pH值变化

总趋势是不断下降,pH值较小既适于产酶也能使已产生的酶失活。因此,适当增大初始pH值可以缓冲发酵过程中酸生成带来的负面影响。一般菌种生长的最适温度与产酶的最适温度都是不一致的,试验中可采用分段升温的办法来提高纤维素酶的产率,变温处理有利于提高酶活力。试验的最适温度为35℃。合适的接种量对产酶有5/2009

457-469.

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Studyoncellulaseactivityproducedbysolid-statefermentationofTrichodermaviride

WANGYi-ming1,ZHANGZong-zhou1,2,LINHai-ming1,

SUNXiao-di3,LEIYan-fang1,WANGDong-ming4

(1.CollegeofAgriculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.SchoolofLife-ScienceandChemistry,TianshuiNormalUniversity,Tianshui740101,China;

3.SchoolofEngineering,TianshuiNormalUniversity,Tianshui740101,China;4.InstituteofAutomation,GansuAcademyofSciences,Lanzhou730000,China)

Abstract:Usingwheatbranandstrawasrawmaterials,optimumtechnologyconditionsofcellulaseac-tivityproducedbysolid-statefermentationofTrichodermaviridewasoptimizedbyorthogonalandsinglefactortest;theeffectofT.virideoncellulosedegradationofwheatstrawwasstudied.Theop-timumconditionswereprovidedtothedegradationofwheatstrawcellulosebyT.viride,andfurtherimprovetheutilizationrateofwheatstraw.TheresultshowedthattherewassignificantdifferenceincellulaseactivityproducedbyT.virideunderdifferentconditions(P<0.05).Theoptimalmedium

2SO4,watercontentcontained8gwheatstrawand2gwheatbran,itsnitrogensourcewas(NH4)

was200%,pHvaluewas5.5.Theoptimumfermentationconditionswereasfollows:96hcultivationtime,35℃,pHvalue6.0,0.4%nitrogencontent,15%inoculumandsemi-enclosedcultivation.TheNDF,ADF,celluloseandhemi-cellulosecontentofwheatstrawafterfermentationdeclinedby5.22%,6.88%,4.73%and4.16%,respectively,andtherewasnosignificantchangeinlignin.Keywords:Trichodermaviride;fermentationconditions;cellulaseactivity;wheatstraw;cellulose