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腺苷酸环化酶及蛋白激酶Ａ在β受体激动增加ｅＮＯＳ活性信号通路中的作用
作者：蒲娟娟 李 涛
来源：《中国实用医药》2008年第18期
【摘要】 目的 阐明β受体激动增加内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性信号通路中腺苷酸环化酶(AC)及蛋白激酶A(PKA)的作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞；运用同位素两步色谱法(［3H］-L-精氨酸转化法)检测eNOS活性。本研究设置空白对照组、AC组和PKA组，每组因素下再分ISO及BSS两个干预因素组，观察AC特异性阻断剂SQ-2256(5×10-5mol/L)及PKA特异性阻断剂H-(1×10-7mol/L)分别与人脐静脉内皮细胞孵育10 min，再与异丙肾上腺素(ISO)孵育30 min后eNOS活性变化。结果 ISO明显增加eNOS活性(30．7±3．9)%,P
【关键词】 人脐静脉内皮细胞；β-肾上腺素能受体；内皮型一氧化氮合酶；腺苷酸环化酶；蛋白激酶A
Essential Role of Adenylyl Cyclase and Protein Kinase-A for Endothelial Nitric Oxide Synthase Activation by β-adrenoceptors Stimulation(β-AR)
PU Juan-juan,LI Tao.Department of Geriatrics,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Henan 450052,China
【Abstract】 Objective To elucidate the role of adenylyl cyclase(AC)and cyclic AMP-dependent protein kinase-A(PKA)in the signal transduction of the endothelial nitric oxide synthase(eNOS)activation by βAR stimulation in human umbilical vein endothelial
cell(HUVEC).Methods HUVEC was isolated and cultured; HUVEC was added SQ-22536(5 10-5
mol/L,AC inhibitor)and H-(1 10-7mol/L,PKA inhibitor)separately for 10 min,then agonist
-min； Evaluation of NOS activity was determined by the conversion of L-［3H］arginine to L-［3H］citrulline.Results Isoprenaline increased ［3H］ L-citrulline formation by(30．7±3．9)%(P 【Key words】
Human umbilical vein endothelial cell;β-adrenergic receptors;Endothelial nitric oxide synthase;Adenylyl cyclase;Protein kinase-A
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血管内皮细胞上表达β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptors,β-AR)，许多实验证实β-AR激动剂引起的血管舒张作用是通过活化eNOS实现[1-4]。Ferro[3]等人发现，体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)上，β-AR激动剂ISO以非Ca2+依赖方式激活eNOS,其中的机制虽不十分清楚，但可能与eNOS蛋白磷酸化有关。有研究显示PKA[5
，6]
可在丝氨酸部位磷酸化eNOS，磷酸化后的eNOS对Ca2+/钙调蛋白敏感性明显增加，形成非Ca2+依赖性的eNOS活化方式。我们近期实验也证实[7]，在培养的HUVEC上β-AR激动增加eNOS活性同时伴eNOS丝氨酸磷酸化水平增加。本次研究我们通过观察AC及PKA的特异性阻断剂对β-AR激活eNOS过程的影响，从而探讨HUVEC上AC及PKA有无参与ISO激动eNOS的过程。
1 资料与方法
1．1 资料
1．1．1 新生儿脐带 由郑州大学第一附属医院妇产科提供，无菌选取健康顺产或剖宫产新生儿脐带，中间无血肿、夹痕。
1．1．2 主要试剂 M199培养基(GIBCO，USA)，ISO、L-NAME、SQ-2256、H-、3H-L-arginine及阳离子交换树脂Dowex 50wx 4-400(H+型)(SIGMA，USA),Comassie Protein Assay Reagent Kit 23200试剂盒(PIERCE，USA)。
1．1．3 主要设备 CO2恒温细胞培养箱(NAPCO,USA)；酶标仪(Model 550 BIO-RAD，USA)；液体闪烁计数仪(Wallac，USA) 1．2 实验方法
1．2．1 人脐静脉内皮细胞分离培养 按Ferro A等人方法[2]改良,传至第三代用于实验。内皮细胞的鉴定依据细胞形态和Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色。
1．2．2 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)eNOS活性的测定 本研究设置空白对照组、AC组和PKA组，每组因素下再分ISO及BSS两个干预因素组，每小组三复管；同位素二步色谱法测定3H-L-citrulline的产量反映eNOS活性。实验具体步骤如下：加入BSS溶液，收集细胞，均分1 ml/管；每管加入预先稀释的3H-L-arginine,1 Ci/管，37℃孵育20 min；每管分别加入相应AC特异性阻断剂SQ-2256(5×10-5mol/L)、PKA特异性阻断剂H-(1×10-7mol/L)及空白对照，37℃孵育10 min；每管分别加入相应ISO(10-6 mol/L)及空白对照(BSS),37℃孵育30 min；每管
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分别加入1 ml含L-NAME的无Ca2+BSS溶液(反应终止液)；离心收集细胞，2 000 转/min 20 min； 每管分别加入0．5 mol/L三氯乙酸1 ml，-70℃反复冻融3次；每管分别加入0．5 ml Dowex 50wx 4-400树脂吸附3H-L-arginine，静置10 min；取上清液1 ml加入闪烁液3 ml,混匀后上闪烁仪测3H-L-citrulline dpm计数(结果须经蛋白定量校正)。
1．2．3 蛋白浓度定量 制备标准品；样品蛋白浓度测量(微孔板测定)；每孔加标准/样品5 μl；每孔再加入250 μl Commassie Reagent,摇晃30 s；停止摇晃，室温下孵育10 min；在595 nm测吸光值；将其他标准/样品管中测值减去空白管测值；画标准曲线，并依次得到样品管浓度。
1．3 数据分析与统计 所有数据以(x±s)表示,采用方差分析及Dunnett t 检验分析(Prism 3．0 统计软件),P 2 结果
eNOS基础活性为(185．1±16．36)dpm•/μg protein，ISO可明显增加eNOS活性
(30．72±3．907)%,(P0．05 vs空白对照组)；而预先加入SQ-22536、H-后再加入ISO，可见ISO增加 eNOS活性的作用受到明显抑制(12．1±3．53)%、(4．73±2．19)%,(P
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3 讨论
eNOS是一种结构型的酶，它的氧化酶区和还原酶区含有多种辅助因子结合位点，钙调素(CaM)与eNOS结合后作为一个分子开关，允许电子流从NOS羟基端还原酶区流向氨基端含血红素区域，为eNOS生成NO所必需。传统的内皮依赖性血管扩张物质如乙酰胆碱、组胺等都是通过提高细胞内游离Ca2+浓度，形成Ca2+/CaM复合物与eNOS结合，促使eNOS与caveolin-1分离导致酶的激活，去除胞外Ca2+以及施加CaM拮抗剂则可抑制eNOS的激活。但目前有证据表明切应力[8]、胰岛素[9]可通过非Ca2+依赖方式激活eNOS。我们既往的实验也表明ISO激活eNOS的途径不依赖Ca2+，这提示 eNOS存在非Ca2+/CaM依赖的激活途径。 长时间以来人们认识到β-AR的信号转导通路上能够激活PKA，这一过程包括β-AR通过Gs蛋白激活AC，AC催化三磷酸腺苷转化为环磷酸腺苷(cyclic AMP,cAMP)，cAMP通过促进PKA的亚基与催化亚基分离从而激活PKA。有研究显示PKA[5
，6]
可在丝氨酸部位磷酸化
eNOS，磷酸化后的eNOS对Ca2+/钙调蛋白敏感性明显增加，形成非Ca2+依赖性的eNOS活化方式。我们既往的实验[3-4,7]表明：β-AR激活eNOS 同时伴细胞内cAMP浓度增加，foskolin(AC激动剂，可增加细胞内cAMP浓度)和dbcAMP(可透过细胞膜的cAMP类似物)可以产生ISO样效应，并且这种效应可因去除血管内皮或给予eNOS阻断剂而消失；β-AR激动增加eNOS活性同时伴eNOS丝氨酸磷酸化水平增加。本次实验显示AC特异性阻断剂SQ-2256、PKA特异性阻断剂H-对ISO增加eNOS 活性均有明显抑制。由此我们推测β-AR激动剂激活eNOS的信号转导通路中可能包括：ISO→β-AR→Gs→AC→cAMP→PKA→eNOS。下一步实验我们需要明确蛋白激酶A是否直接参与eNOS丝氨酸磷酸化过程。
交感肾上腺素系统和内皮L-arg/NO系统在心血管功能调节、血管内环境稳定中都起着极其重要的作用。认识和了解这二者之间内在联系和相互调节，无论对我们从新的角度了解和探索循环系统生理、病理机制，还是寻找针对冠状动脉粥样硬化、原发性高血压、心力衰竭、糖尿病等血管内皮功能障碍的治疗对策以及设计开发临床改善内皮功能的新药都具有重要意义。 参考文献
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