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实验二 Feulgen反应显示DNA
学生姓名 学号 班级
座位号： 同组同学 日期： 2014 年 10 月 14 日 备注：
【Introduction】
常用DNA定性和定量分析的方法及原理：
（1）Feulgen反应：DNA经酸水解后，分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。
（2）甲基绿-派洛宁法：甲基绿-派洛宁为碱性染料，分别与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。
（3）HE染色：即苏木精-伊红染色法。苏木精染液为碱性，使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
（4）Giemsa染色：含天青、伊红等，可与DNA上的磷酸基团结合，使染色体呈蓝紫色，而细胞质呈淡蓝色。
（5）免疫荧光技术：将已知的抗原或抗体标记上荧光素，反应后，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的黄绿色或桔红色荧光，从而确定抗原或抗体的定位，测定含量。
（6）显微光度术：利用显微分光光度计对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用不同的荧光经荧光探针标记后进行定位、定性和定量地测定。
（7）流式细胞术：在细胞分子水平上对单个细胞或其他生物粒子进行多快速的定量分析，可以高速分析上万个细胞，并能同时测量细胞的物理或化学性质。
【Materials & methods】
实验材料：
四膜虫培养液（200μl）；Carnoy固定液；Schiff试剂；1mol/L HCl；自来水；亮绿溶液；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；恒温水浴锅两台（60℃），恒温培养箱一台（30℃）。 实验操作：
吸取少量四膜虫培养液于载玻片→干燥→用卡诺固定液固定10到20分钟→在盐酸内水浴15分钟左右→用Schiff试剂染色40分钟（要避光、30度恒温）→自来水清洗2次→亮绿溶液复染1到2秒钟→再次水洗→干燥→放在显微镜下观察。
【Real-time Record】
实时记录草稿请见附录。
流程 具体步骤 备注 1 制片 移液器吸取10μl四膜虫培养液，反复混匀几次，滴于在玻片一角做不对称图案记号 干净的载玻片的一侧，涂成直径约1cm的圆。标记载玻片。制作4个对照。 置于30℃恒温箱中干燥10-15分钟。 2 固定 将标本片置于Carnoy固定液中固定10~20分钟，吸去玻片背面的液体 如果记号被抹去了要补上 3 酸解 实验组：放入1mol/L盐酸中，60℃水浴15分钟 对照1：置于空气中，不经盐酸处理。 对照2：置于1mol/L盐酸中，室温15分钟。 两组合做，每组两个对照片 对照3：放入1mol/L盐酸中，60℃水浴10分钟。 对照4：放入1mol/L盐酸中，60℃水浴20分钟。 4 染色 将所有标本片同时放入Schiff氏液中作用40分钟（30℃恒温箱；避光） 可背贴背放置 5 清洗 将所有标本片迅速从Schiff试剂中提出放入自来水中浸泡1分钟，重复2次 动作要快防止残留的无色品红被氧化成有色品红，引起假阳性 6 复染 将标本片放入％亮绿水溶液复染1~2秒钟； 将标本片在干净的自来水浸泡，滤纸吸去玻片背面和两侧的水分并在空气中干燥 将载玻片浸入亮绿溶液后随即提出，一张张依次复染 7 镜检 选择40X镜绘制1~2个细胞并上传1~2张图片 标本彻底干燥后方可观察 【Results】
40倍物镜下可观察到实验组的四膜虫细胞核染上了红紫色，而细胞质为绿色。 生物绘图请见附录。
【Discussion】
1. 讨论实验为何出现所得结果。若实验结果不理想，请分析是何原因如何改进
答：由于时间比较紧，我们简单设置了60℃下三个不同时间的组别，但是这样的话差别比较小。应该设置不同温度的对照，因为酸水解是本实验成败的关键之一，温度必须保持在60±5℃之间，改动温度的话就能得到比较鲜明的对比了。
实验组别 细胞核颜色 细胞质颜色 原因分析 实验组0（盐酸红色 绿色 细胞核染成粉红色至紫红色，经亮绿处理的细胞的细60℃15min） 胞质显绿色。 对照组1（空气绿色 绿色 DNA没有被酸水解，细胞核显示出被亮绿染上的绿色，无红色出现，细胞质显绿色。 室温15min） 对照组2（盐酸浅红 绿色 温度过低，DNA水解不够彻底，醛基暴露不充分，染色过浅。细胞质显绿色。 室温15min） 对照组3（盐酸浅红 绿色 时间过短，DNA水解不够彻底，醛基暴露不充分，细胞核染色过浅。 60℃10min） 对照组4（盐酸浅红 绿色 时间过久，造成DNA水解过度，游离的核苷酸漂移到细胞质中，造成染色浅或不均一。 60℃20min） 2. 分析Feulgen染色实验设置对照的必要性。请发挥所学知识设计对照方案！
答：Feulgen染色实验设置对照，一方面是为了排除干扰例如人为误差、系统误差等等，另一方面是为了体现本实验具有专一性，说明该反应是很有效的。因此除了原本的实验组以外，我们还需要设计三种对照：阳性对照、阴性对照、空白对照。其中阳性对照与要进行的实验内容很相似但不相同，能够得出阳性的结果，体现了Feulgen染色的有效性。阴性对照加了某种处理因素，其他条件全部都相同，应该得到阴性结果，例如改变盐酸水浴的温度等等，用来排除其他因素干扰。空白对照则是不加处理因素，例如用蒸馏水代替，可以检测周围环境是否稳定。
【Questions】
1. 如果用Feulgen反应对小鼠精子细胞和肝细胞进行DNA含量的检测，能确定其中的倍数关系吗（精子细胞为一倍体；幼鼠肝细胞二倍体；成年鼠肝细胞包括二倍体、四倍体和八倍体等多倍体）
答：能。小鼠细胞DNA经过Feulgen反应形成的紫红色产物能特异地吸收550~570nm的光波，并且在一定的浓度范围内，该产物对550~570nm光波的吸收值与DNA含量成正比关系。因此可以通过测定相同条件下小鼠精子细胞和肝细胞Feulgen反应产物的吸光度，来确定它们DNA的倍数关系，可以应用Feulgen显微分光光度法来检测DNA含量。
2. 四膜虫有两个细胞核，大核位于细胞中部，直径约10微米，小核位于大核附近，直径为微米，它们在遗传上发挥不同的作用。你能在实验中观察到这两个细胞核吗 它们各自具有什么作用呢
答：理论上在本实验中可以观察到小核，但是我这次只看清楚了大核。大核负责基因的转录, 决定了细胞的表型。小核负责遗传物质的传递，对细胞表型无影响。在有性生殖过程中，小核进行两次减数和一次有丝，形成配子核，交换后融合形成合子核，合子核通过有丝，形成两个新的大核和两个新的小核，随后亲本大核降解。[1]
【References】
[1] 许静. 嗜热四膜虫三种含有锌指结构域蛋白的功能研究. 山西大学. 2013.
