hsp90及c-myc在小鼠肠道腺瘤癌变中的表达及相关性

•论著•

HSP90及c-Myc在小鼠肠道腺瘤癌变中的表达及相关性

沈晓东张天边涛

【摘要】

目的研究热休克蛋白90 (HSP90)及c-Myc在小鼠肠道腺瘤癌变中的表达及相关性。方法采集5周及8周ApcA716/+小鼠的肠道

标本，通过Western blot、免疫组织化学染色及RT-PCR明确肠道腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的表达情况及相关性。结果腺瘤癌变组织 中HSP90及c-Myc的Western blot条带均较良性腺瘤明显增强；免疫组织化学染色见腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc均着色明显，其相对表达量 较良性腺瘤明显升高（^均<0.001);腺瘤癌变组织中^15?90及(：-!^^(：的1111^^八的相对值较良性腺瘤明显升高（1)均<0.001);^^?90及£：-]\\^〇 的mRNA表达具有明显相关性（r=0.710, i^O.002)。结论肠道腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的表达均明显提高，二者表达具有明显的相 关性，说明HSP90可能与c-Myc相互作用，在腺瘤癌变中发挥作用。【关键词】 热休克蛋白9〇 c-Myc腺瘤癌变

【Abstract 】 Objective To investigate the expression and correlation of heat shock protein 90 ( HSP90 ) and c—Myc in the carcinogenesis

of intestinal adenoma in mice. Methods The intestinal specimens of 5—week—old and 8—week—old ApcA716/+ mice were collected. Western blot, immunohistochemical staining, and RT—PCR were performed to determine the expression and correlation of HSP90 and c—Myc in adenocarcinoma.

Results The Western blot strips of HSP90 and c—Myc extracted from adenocarcinoma were obviously enhanced compared with benign adenomas.

The adenocarcinoma cells were stained strongly, and the relative expression values of HSP90 and c—Myc in adenocarcinoma were significantly increased compared with benign adenoma ( P all<0.001 ) . The relative mRNA values of HSP90 and c—Myc in adenocarcinoma were significantly higher than those of benign adenomas ( P all<0.001 ) . The niRNA expression of HP90 and c—Myc in intestinal adenocarcinoma showed a positive correlation ( jR=0.710, P=0.002 ) . Conclusion The expressions of HSP90 and c—Myc in intestinal adenocarcinoma increases significantly compared with benign adenoma, and there is positive correlation between the expression of HSP90 and c—Myc. So HSP90 may interact with c—Myc and play a role in carcinogenesis of intestinal adenoma.【Key words 】

Heat shock protein 90 C—Myc Adenoma Carcinogenesis

结直肠癌是全世界第3大高发恶性肿瘤，每年新 世界居第4位〜。大量研究表明，WNT信号通路中 诊断病例高达1200万在恶性肿瘤中病死率在全

卩-catenin及c-Myc等活性升高是大多数结直肠腺瘤 癌变及结直肠癌形成及进展的重要特征[3<，其发病 基金项目：沈阳医学院归国留学科研启动基金（20175049)机制与MYC等原癌基因及APC等抑癌基因发生突变 作者单位：110034辽宁省沈阳二四二医院（沈阳医学院附属第三

有关〜，c-MYC是这些信号通路最重要的癌基因之

医院）

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1146-1154.

• 168 •一 [5]。ApcA716/+小鼠模型具备典型的息肉-腺瘤-癌 变过程，并且有与人类高度同源性、遗传性强、操作 简便等优点，是国际公认的研究结直肠腺瘤癌变及结 直肠癌的小鼠模型W。热休克蛋白作为分子伴侣与发 生变性的蛋白结合而维持其正常的结构和功能，可分 为HSP90、HSP70、小分子HSP等，其中HSP90在 很多恶性肿瘤中表达明显升高，并且在恶性肿瘤的发 生、发展及免疫反应中起着重要的作用[7]。本研究采 用Apr^〜小鼠，研究肠道腺瘤癌变组织中HSP90及

c-Myc的表达情况及相关性，为HSP90应用于预防肠

道腺瘤癌变提供重要的理论依据。

1实验方法1.1材料HSP90鼠抗人单克隆抗体Ubl3492)由 艾博抗公司提供，c-Myc鼠抗人单克隆抗体（SC-40) 圣克鲁斯生物技术公司提供，ECL发光试剂盒由阿默 舍姆制药生物技术公司提供，标第一链合成系统n由 赛默飞生命科学公司提供，其他试剂均为实验用。1.2方法（1 )动物：ApcA7l6/+小鼠由Oshima教授馈 赠，小鼠繁殖及扩增在SPF环境中，APcA716/+雄性小 鼠及野生型雌性小鼠进行交配扩增，剪取尾尖基因鉴 定，选出ApCA716/+小鼠作为本实验用。（2)肠道腺瘤 癌变的判定：通过对2~12周ApcA716/+小鼠肠道标本进 行体视显微镜以及HE染色检测发现，4周开始出现 肠道腺瘤，5〜7周小鼠肠道腺瘤均为良性；8周时腺瘤 开始出现癌变，癌变数为1〜3枚/只，腺瘤癌变与大 小有直接相关，故选取8周最大的肠息肉作为癌变的 息肉（同时切取小部分HE染色证明其已经发生癌变）, 选取5周的1.0mm肠道良性腺瘤作为对照。

1.3 Western blot法检测腺瘤癌变组织中HSP90及 c-Myc的表达通过体视显微镜采取5周正常黏膜、 良性腺瘤及8周癌变息肉，细胞提取物通过10% SDS- PAGE凝胶电泳分离及半干式转膜转膜，第一抗体选 用鼠抗人HSP90及c-Myc抗体，滴加二抗，ECL发光 试剂检测结果。

1.4腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc免疫组织化学 染色选取5周及8周小鼠各8只，处死后分离肠道， 固定，石蜡包埋，5pm切片，通过HE染色 明确腺瘤癌变部位；滴加HSP90或c-Myc单克隆抗体， 4T冰箱密封过夜，滴加二抗，温育30min后DAB显色。 染色阳性判定标准：棕黄色颗粒沉积的部位为染色阳 性，肿瘤细胞r-Myc全部为细胞核着色，HSP90则绝 大部分细胞核染色，少部分肿瘤细胞细胞质轻微着色。 HSP90及c-Myc蛋白质的相对表达量由染色细胞比率 及着色强度的乘积来判定，由两名专业人员双盲下评分。1.5 RT-PCR法检测腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc

浙江临床医学2020年2月第22卷第2期

的mRNA选取5周及8周APcA716/+小鼠各16只，处 死小鼠后，无RNA酶条件下分离出整个肠道，体视 显微镜下切取5周小鼠良性腺瘤及8周癌变的息肉， Trizol试剂盒提取总RNA,标第一链合成系统II试剂 盒合成 Hsp90 及 c-Myc 的 cDNA, Hsp90 及 c-Myr 的 引物应用ABI PRISM引物设计软件确定，PCR扩增后 使用ABI PRISM* 7000型序列检测系统检测PCR反应 结果。

1.6统计学方法采用SPSS 17.0统计软件。计量 资料采用t检验或方差分析检验；相关性分析采用 Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

2.1 APCA71«+小鼠肠道腺瘤癌变情况4周开始出现 肠道腺瘤，5周腺瘤总数为（7.6±3.1)个，均为良性 腺瘤；8周小鼠肠道息肉总数为（68.8 ±12.8)个/只， 其中出现癌变者（1.7 ±1.1)个/只，恶变与体积大小 相关，体积较大者首先开始癌变。

2.2肠道腺瘤癌变组织中的HSP90及c-Myc蛋白表 达通过蛋白电泳发现，正常肠黏膜HSP90及c-Myc 表达量低，条带显示淡；5周时腺瘤内HSP90及c-Myc 表达量升高，8周腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc蛋 白条带明显增强，与良性腺瘤比较比较明显不同，见 图1。

黏膜 腺瘤 癌变

图1 HSP90及c-Myc■在肠道腺瘤及腺瘤癌变组织中的表达

2.3肠道腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc免疫组织 化学染色腺瘤癌变组织中HSP90染色阳性细胞明显 增多，染色增强，绝大部分位于细胞核内，少部分位 于细胞质内，其相对表达量为（6.91±1.19)，较良性 腺瘤（1.70±0.61)显著升高（t=-11.038, P<0_001 ); c-Myc免疫组织化学染色结果与HSP90相似，腺瘤癌 变组织中达也明显增多，主要位于细胞核内， 其相对表达量为（7.31 ±1.22),较良性腺瘤(2.14 ±0.80) 也显著升高（仁-9.722, P<0.001),见图2。

2.4肠道腺瘤及腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的 mRNA表达腺瘤癌变组织中HSP90mRNA表达量

浙江临床医学2020年2月第22卷第2期o

do»x

为（0.62±0.08),较良性腺瘤（0.21 ±0.06)明显升 高（t=-17.246, P<0.001 );腺瘤癌变组织中 c-Myc 的mRNA表达量为（0.95±0.10),也较良性腺瘤 (0.31 ± 0.05 )明显升高 0-23.917, P<0.001 )。

2.5肠道腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc表达的相

关性将腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的mRNA 相对值等结果进行相关性分析，结果显示HSP90及

c-Myc的mRNA表达存在明显的正相关（r=0.710,

P=0.002 )。同样，对免疫组织化学染色中HSP90及 c-Myc的相对表达量相关性进行分析，结果与mRNA 相对值相似 U=0.925, P=0.001 )。

3讨论

目前HSP90在肿瘤方面研究日益深入，HSP90不

仅在多种恶性肿瘤免疫治疗中起到重要的作用，血浆 HSP90还可作为肿瘤标志物用于许多恶性肿瘤的诊断， HSP90-多肽复合物对胃肠道恶性肿瘤具有明确的抗肿 瘤活性，并已经进入临床试验阶段，故HSP90适合作 为肠道腺瘤癌变及结直肠癌免疫治疗的靶点而进一步 深人研究。

原癌基因MYC突变后，其编码的蛋白c-Myc可 以介导生物信号由细胞外转导人细胞核内，在肿瘤的 形成及发展中起到重要的作用；大量研究表明c-Myc 在肠道腺瘤形成及癌变中起到重要作用[8] ; HSP90则 通过c-Myc参与很多恶性肿瘤的发生及发展过程[9]; 本研究通过检测HSP90及c-Myc在ApcA716/+小鼠肠道 腺瘤癌变组织中的表达及相关性，推测HSP90在肠道 腺瘤癌变中的作用机制，为防治肠道腺瘤癌变提供新 选择。

本实验中，在8周左右ApcA716/+小鼠腺瘤刚开 始出现癌变，通过蛋白电泳、免疫组织化学染色及 RT-PCR等实验方法证明，腺瘤出现癌变时，无论在 mRNA水平还是在蛋白质水平HSP90及c-Myc均较良 性腺瘤时显著升高；并且腺瘤癌变组织中，HSP90与

c-Myc的mRNA表达及蛋白质表达均具有明显相关性， 说明HSP90可能通过与c-Myc相互作用，参与肠道腺

• 169 •

瘤癌变的。

HSP90参与肠道腺瘤癌变的机制目前尚不明确， Poole教授等⑷研究表明Myc-HSP90轴是维持许多恶 性肿瘤发生及发展的关键，本实验研究结果与Poole 教授的研究结果相似，HSP90及c-Myc在肠道腺瘤癌 变组织中显著升高并具有相关性，提示HSP90可能通 过c-Myc参与肠道腺瘤癌变，其作用机制可能有以下 几个方面：（1 ) HSP90作为分子伴侣维持c-Myc正常

构象及功能，促进肿瘤恶变，这可能是主要机制；（2) HSP90通过表观遗传过程参与c-Myc的转录，促 进c-Myc的转录及翻译，提商c-Myc表达水平；（3 ) HSP90通过与一些转录因子相互作用，提髙c-Myc的 mRNA稳定性。但现阶段HSP90与c-Myc间具体信号 通路尚不完全清楚，需要进一步研究明确HSP90促进 肠道腺瘤癌变的具体机制。

本研究中，在8周Ape小鼠肠道腺瘤开始出 现癌变时，腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的mRNA 及蛋白质表达水平均较良性腺瘤显著升高，并且 HSP90及c-Myc的表达具有明显相关性，提示HSP90 通过c-Myc参与肠道腺瘤癌变。本研究探索了 HSP90 在肠道腺瘤癌变中表达的及作用机制，为预防肠道腺 瘤癌变提供新策略。

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