重庆医学２０１５年２月第４４卷第５期 ６２３ 论著・临床研究ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—８３４８．２０１５．０５．０１５ 急性胰腺炎患者外周血单核细胞ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ的表达及意义 曾玉剑 ，刘 霜。，孙 亮 ，舒 若 。，施承民 ， 郭姝婧 ，费昱达 ，王昆华 ，罗华友 ，。△ （昆明医科大学第一附属医院：１．胃肠与疝外科；２．云南省消化病研究所；３．干疗科，昆明６５００３２） 摘 要：目的 观察急性胰腺炎（ＡＰ）患者外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）Ｔｏｌｌ样受体９（ＴＬＲｇ）ｍＲＮＡ的表达情况。方法 收集 ５２例发病２４ ｈ内的ＡＰ患者，采集第１、３、５天外周乙二胺四乙酸二钾（ＥＤＴＡＫｚ）抗凝静脉血，提取血浆低温冻存，用于成批检测 胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子、抗炎细胞因子等。同法采集其治愈后２～３个月的外周ＥＤＴＡＫ 抗凝静脉血行上述检测，作为相 应指标的基准水平值。分离外周血单核细胞用于随后成批作逆转录聚合酶链反应（ＲＴ＿ＰＣＲ）检测ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ的表达变化规 律。同法采集其治愈后３个月的外周ＥＤＴＡＫｚ抗凝静脉血行上述检测，作为相应指标的基准水平值。最终将成功采得治愈后３ 个月血液标本的前３６例患者纳入最终研究。结果 ＡＰ患者的外周血ＰＢＭＣｓ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ相对含量高于其痊愈后３个月的基 线水平（Ｐ＜Ｏ．０５）。ＡＰ患者的外周血ＰＢＭＣｓ ＴＬＲ９ ＲＮＡ相对含量表达改变与胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子水平呈正相关，与 抗炎细胞因子无相关性。结论ＡＰ患者的外周血ＰＢＭＣｓ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ表达显著升高并与促炎细胞因子表达同步上调，提示 ＡＰ的发生、发展可能通过ＴＬＲ９介导。 关键词：Ｔｏｌ１样受体９；急性胰腺炎；外周血单核细胞 中图分类号：Ｒ６５７．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－８３４８（２０１５）０５—０６２３—０３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ Ｚｅｎｇ Ｙｕｊｉａｎ１，２，Ｌｉｕ Ｓｈｕａｎｇ。，Ｓｕｎ Ｌｉａｎｇ ，ＳｈｕＲｕｏ ，Ｓｈｉ Ｃｈｅｎｇｍｉｎ１，２， Ｇｕｏ Ｓｈｕ ｉｎｇ ，Ｆｅｉ Ｙｉｄａ ，Ｗａｎｇ Ｋｕｎｈｕａ ～，Ｌｕｏ Ｈｕａｙｏｕ ，。 （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ；２．Ｙｕｎｎａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｄｒｅ Ｈｅａｌｔｈ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａ｝｝ｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ６５００３２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｆｔｙ ｔｗｏ ＡＰ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ２４ ｈ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ＥＤＴＡＫ２ ｃｏａｇ— ｕｌａｔｉｏｎ ｖｅｉｎ ｂｌｏｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ，ｔｈｉｒｄ ａｎｄ ｆｉｆｔｈ ｄａｙ，ｔｈｅｎ ｐｌａｓｍａ ｗｅｒｅ ｃｒｙｏｐ ｒｅｓｅｒｖｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｌａｓｔａｓｅ， ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ＥＤＴＡＫｚ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｖｅｉｎ ｂｌｏｏｄ ｔｗｏ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｍｏｎｔｈｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｕｎｄｅｒｔａｋｅ ｔｈｅｓｅ ｔｅｓｔｓ，ａｎｄ ａｃｔ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌｅｖｅ１ ｖａｌｕｅ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３６ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｈｒｅｅ ｍｏｎｔｈｓ ｌａｔｅｒ，ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅｓｅ ３６ ｐｅｏ— ｐｉｅ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＰＢＭＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ Ｆｉｃｏｌｌ—Ｈｙｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ＲＴ＿ＰＣＲ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎ－ ｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ＰＢＭＣｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ— ｌｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ ａ ａｎｄ ＩＬ一１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｐａｎ－ ｃｒｅａｔｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＴＬＲ９． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９；ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ 急性坏死性胰腺炎（ａｕｔｅ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ＡＮＰ）的 治疗是一个医学难题。无论基础研究还是临床实践都尚未能 取得根本性的突破：（１）ＡＮＰ发病机理的研究尚无重大突破性 发现，现有发病理论不足以解释急性胰腺炎（ＡＰ）的发生、发 展；（２）ＡＮＰ的发病率及病死率逐年上升，现美国每年ＡＰ患 者约１８５ ０００例；其中２５ 发展成为ＡＮＰ，后者的病死率高达 ５Ｏ 。中国虽缺乏详尽的统计资料，但局部地区大宗病案报道 也提示ＡＮＰ的病死率呈上升趋势。ＡＰ发病始动环节不清、 对ＡＮＰ发生、发展的分子基础及发病机制认识不足，是ＡＰ治 动机体炎反应链。为探寻ＴＬＲ９是否参与了人的ＡＰ，本研究 检测了ＡＰ患者外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）的ＴＬＲ９表达情况， 以及其与常见炎症相关细胞因子的相关性，现报道如下。 １资料与方法 １．１一般资料选择２０１０年３月至２０１０年８月本院急诊科 观察室收治的５２例发病２４ ｈ内的ＡＰ患者；诊断标准：采用人 民卫生出版社第７版外科学教材。采集５２例患者第１、３、５天 外周乙二胺四乙酸二钾（ＥＤＴＡＫ２）抗凝静脉血，提取血浆低温 冻存，用于成批检测胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子（ＴＮＦ－ａ、ＩＬ一 １）、抗炎细胞因子（Ｉ１ 一４）等。同法采集其治愈后３个月的外周 ＥＤＴＡＫｚ抗凝静脉血行上述检测，作为相应指标的基准水平 疗效果难如人意及ＡＮＰ病死率居高不下的根本原因。Ｔｏｌｌ 样受体（Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＩ Ｒｓ）是备受关注的一种哺乳动 物细胞表面信号传导跨膜蛋白，在天然免疫识别病原体及介导 炎性反应信号通路中有重要作用。ＴＩ Ｒ９是ＴＬＲｓ家族成员 中的重要一员，通过识别外源性的非甲基化ＣｐＧ基序从而启 值。分离ＰＢＭＣｓ用于随后成批作逆转录聚合酶链反应（ＲＴ＿ ＰＣＲ）检测ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ的表达变化规律。同法采集其治愈 后３个月的外周ＥＤＴＡＫｚ抗凝静脉血行上述检测，作为相应 ＊ 基金项目：云南省教育厅基金（２０１０Ｙ１７０）。 作者简介：曾玉剑（１９７５一），讲师，博士，主要从事胃肠肿瘤、疝和腹壁外科疾病、急性胰腺 炎的临床及研究工作。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕａｙｏｕｌ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｒｎ。 ６２４ 指标的基准水平值。最终将成功采得治愈后３个月血液标本 的３６例患者纳入研究，其余１６例排除。全部患者皆诊断明 确，同时确认其３个月内未曾接受糖皮质激素、免疫抑制剂或 具有免疫调节作用的药物治疗。患者年龄３１～５４岁，平均 （４７．１４－１．９）岁。 １．２试剂人淋巴细胞分离液、Ｆｉｃｏｌｌ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（北京 鼎国生物技术有限公司），ＤＥＰＣ（Ｓｉｇｍａ公司），Ｔｒｉｚｏｌ试剂（Ｉｎ— ｔｒｉｖｏｇｅｎ公司），Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ逆转录酶（ＴＯＹＯＢＯ生物科技 公司）。 １．３方法 １．３．１ ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ的ＲＴ—ＰＣＲ检测 （１）ＰＢＭＣｓ的分离， 抽取研究对象空腹静脉血１５ ｍＩ ，Ｆｉｃｏｌｌ法分离ＰＢＭＣｓ。（２） ＰＢＭＣｓ总ＲＮＡ用Ｔｒｉｚｏｌ按说明提取，用Ｔｒｉｚｏｌ一三氯甲烷一异 丙醇一乙醇法提取ＰＢＭＣｓ总ＲＮＡ。（３）逆转录引物，由 ＴＡＫＡＲＡ（中国大连）设计并合成：ＴＩ Ｒ９Ｆ，５Ｉ＿ＴＣＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＡＧＡ ＧＧＴ ＡＣＴ ＴＣ－３ ：ＴＬＲ９Ｒ，５ 一ＴＣＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＴＧＡ ＡＧＴ ＴＧＴ ＧＡ一３ ；ＴａｑＭａｎ探针：５ 一ＦＡＭ—ＣＴＡ ＧＡＡ ＧＴＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＧＴＣ—ＦＡＭＲＡ一３ 取５“ｇ ＰＢＭＣｓ总 ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ，再取５／，Ｌ ｃＤＮＡ进行扩增，扩增出的 产物行１．５ 琼脂糖电泳。用ＧＡＰＤＨ作为内对照，其引物 为：ＧＡＰＤＨＦ，５＇－ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＧＡ ＡＣＣ ＡＣＧ ＡＧＡ—Ａ一３ ； ＧＡＰＤＨＲ，５＇－ＧＧＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＧＴ ＧＧＴ－ＣＡＴ ＧＡ一３ ；Ｔａｑ— Ｍａｎ探针：５｜＿ＦＡＭ—ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡ ＡＣＴ ＧＣＴ ＴＡＧ ＣＴＡ ＭＲＡ一３ 。（４）逆转录反应合成ｃＤＮＡ，取ＲＮＡ １ ｇｇ加入ｏｌｉｇｏ Ｔ １ Ｌ，５×Ｂｕｆｆｅｒ ４ Ｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ Ｉ ，ＲＮＡ酶抑制 剂１ Ｉ ，ＤＥＰＣ水加至２Ｏ Ｌ。反应条件：４２℃２０ ｍｉｎ，９９℃５ ｍｉｎ，４℃５ ｍｉｎ。（５）ＰＣＲ检测ＴＩ Ｒ９、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡ表达相对 含量，ＴＩ Ｒ９、ＧＡＰＤＨ的引物序列设计应用在线引物设计软件 Ｐｒｉｍｅｒ ３．０，由上海博亚生有限公司合成。扩增体系及反应条 件：取２ Ｉ ｃＤＮＡ，５ Ｌ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，２ Ｉ ｄＮＴＰｓ，上游、 下游引物各２ Ｌ、１ Ｉ Ｔａｑ酶，加灭菌双蒸水至总体积５Ｏ Ｉ ； ９４。Ｃ ５ ｍｉｎ预变性，９４℃３０ ｓ，５６℃３０ ｓ，７２。Ｃ ３０ ｓ，共３Ｏ个 循环，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物用１．５ ．的琼脂糖凝 胶进行电泳，采用凝胶成像分析系统中进行图像分析。以 ＧＡＰＤＨ为内参照半定量，各样本表达强度一样本灰度值／ ＧＡＰＤＨ灰度值。 １．３．２ 血清淀粉酶和脂肪酶的测定 抽取研究对象ＥＤ— ＴＡＫ。抗凝静脉血５ ｍＬ。淀粉酶和脂肪酶的测定在昆明医科 大学第一附属医院生化中心的自动生化仪（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ５４００，日本）上进行。 １．３．３细胞因子检测 抽取研究对象ＥＤＴＡＫ 抗凝静脉血 ５ ｍＬ，在常温下离心后收集上层血清保存于一８０。Ｃ冰箱，用于 细胞因子的检测。ＴＮＦ＿ 、ＩＩ 一１和ＩＬ一４用ＥＩＡＳＡ试剂盒 （Ｒ８ＬＤ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）来进行测定。最后用全自动定量绘 图酶标仪（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｍ５５０、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）来判断结果。 １．４统计学处理 采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件进行分析，计量 资料以 ±ｓ表示，采用非配对Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ检验和方差分析 （ＡＮ０ＶＡ）。ＲＴ－ＰＣＲ的结果则表达为平均值（ＡＣｔ），并采用 Ｍａｎｎ—ＷｈｉｔｎｅｙＵ进行检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学 意义。 ２结 果 ２．１血清淀粉酶和脂肪酶 血清淀粉酶和脂肪酶结果随ＡＰ 的发展而呈现较为一致的变化；两酶在第１天组就都已经明显 升高。淀粉酶（Ｐ＜０．０５）与脂肪酶都在第１天（Ｐ＜０．０５）达到 峰值。但随后，淀粉酶呈逐级回落，而脂肪酶则在第３天快速 重庆医学２０１５年２月第４４卷第５期 回落，第５火时脂肪酶甚至降至近基线水平（Ｐ＞０．０５），见 表１。 表１ 血清淀粉酶和脂肪酶检测结果（ ±ｓ） ：Ｐ＜０．０１，与对照组比较；一：此项无数据。 ２．２血清细胞因子检测结果 每个组的血清ＴＮＦ—ａ、Ｉｉ 一１和 ＩＬ一４用ＥＩ ＩＳＡ进行检测（表２）。３种细胞因子表现为在不同 时段的上调；ＴＮＦ—ａ表现为缓慢的上调并在第５天组出现峰 值；ＩＬ一１表现为快速上调，其后缓慢上升，峰值出现于第５天 组；ＩＩ 一４峰值出现于较早的第１天组，其后逐渐下降。 表２ 血清细胞因子检测结果（ｉ±ｓ） ：Ｐ＜０．０５，与对照组比较；＃：Ｐ＜０．０１，与对照组比较。 ２．３ ＲＴ—ＰＣＲ结果 自ＲＮＡ逆转录而来的ｅＤＮＡ经凝胶电 泳证实为目的片段大小（１１３ ｂｐ）。用Ｔａｑｍａｎ探针对ＴＩ Ｒ９ ｍＲＮＡ表达进行定量分析；其结果揭示，在ＡＰ的前１周内， ＴＩ Ｒ９在ＰＢＭＣｓ中呈现出明显的表达上调。ＴＩ Ｒ９ ｍＲＮＡ在 第１天明显上调至对照组的７．８９（２ ）倍（Ｐ＜０．０５）。随后， 第３、５天组呈现缓慢上调表现（Ｐ＜０．０５），于第５天组达峰 值，分别为对照组的８．９４（２ ）倍，９．５１（２ ）倍。 ３讨 论 ＡＰ是一种常见而严重的疾病，但其发病机制仍未能完全 阐明；其中，重症胰腺炎病死率仍较高。作为一类新的跨膜蛋 白，ＴＩ Ｒ家族的发现给ＡＰ发病机理探索提供了新的途径。 ＴＬＲ９在其家族中较晚被发现，通常被认为主要表达于Ｂ细 胞、树突细胞等免疫细胞 】。但是，最近有报道一些ＴＬＲ家 族成员也可以表达于某些上皮细胞 ］。此外，在一些肿瘤细胞 上也有ＴＩ Ｒ９高表达的报道＿６。 。这些发现说明ＴＬＲ９确实 可以在一些免疫细胞甚至非免疫细胞上表达，并进一步提示在 这些细胞上ＴＩ Ｒ９的作用可能并不是识别ＣｐＧ基序。 本研究小组曾经对大鼠胰腺组织是否有ＴＬＲ９表达进行 过检测［１］。免疫组织化学提示ＴＩ Ｒ９主要表达在胰管，特别在 胰管上皮。作者前期的实验也发现，ＴＬＲ４在胰管上皮也有表 达；这是否提示ＴＬＲ９和ＴＩ Ｒ４存在着一致或协同的作用。胰 管黏膜屏障（ＰＤＭＢ）ｌ】 ］是一种被广泛认同的胰管自身的保护 机制；通常认为它的保护作用既包括机械性隔离因素，也包括 化学性机制。作为先天性免疫系统的一种重要受体，ＴＩ Ｒ９在 胰管的表达揭示 一种可能，ＴＬＲ９激活和其后细胞因子释放 也许参与了ＰＤＭＢ的抗炎作用调节。据此，ＴＬＲ９也可能为一 个潜在的免疫调节点。免疫组织化学也揭示ＴＩ Ｒ９着色于胰 腺的血管内皮系统。微循环损害是ＡＰ的早期病理改变之一； 作者前期的实验也提示ＴＬＲ４可能参与这一损害［１ 。ＴＩ Ｒ９ 重庆医学２０１５年２月第４４卷第５期 的免疫组织化学检测结合其实时ＲＴ—ＰＣＲ结果揭示，ＴＬＲ９可 能涉及胰腺炎早期的血管微循环损害。 上述实验证实，大鼠胰腺是存在ＴＬＲ９表达的。作者随后 的研究亦证实，ＴＩ Ｒ９与大鼠实验性胰腺炎的发生、发展存在 相关性。所以，本实验的目的在于希望将在动物实验的结论在 人体中得到某种程度的验证。但由于伦理学的原因和客观上 很难以直接获取胰腺炎时的人体胰腺组织，所以只能从较容易 获取的其他组织的检测来间接证实或推测ＴＩ Ｒ９在人类ＡＰ 时的作用和参与度。而ＴＩ Ｒ９在人体ＰＢＭＣｓ的表达已经得 到证实，鉴于此，本研究决定提取并检测ＡＰ患者外周血的单 核细胞。 作者用外周静脉血行淀粉酶、脂肪酶检查作为判断ＡＰ的 指标，这些指标提示典型ＡＰ改变。 ３．１早期ＡＰ患者ＰＢＭＣｓ ＴＬＲ９表达变化规律 为了探究 ＴＬＲ９与胰腺炎的关联性，实时ＲＴ－ＰＣＲ被用于对ＴＬＲ９ ｍＲ— ＮＡ表达进行定量分析。实时ＲＴ—ＰＣＲ结果证实ＴＩ Ｒ９ ｍＲ— ＮＡ在人外周血单核细胞为低水平表达，但在ＡＰ早期，ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ表达即已经上调明显。ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ上调迅速，在第１ 天时已经上升７．８９（２。 ）倍（Ｐ＜０．０５），其后逐渐上调并在第 ５天时达到峰值，约为对照组的９．５１（２。 ）倍（Ｐ＜０．０５）。这 充分说明ＴＬＲ９对于人类ＡＰ反应迅速，ＴＬＲ９参与了ＡＰ的 发展。随后１周时间内，ＴＬＲ９表达并未出现明显得下调，而 是维持在一个高水平上的缓慢上调。Ｌｉｎｄａｕ等 提出，ＣｐＧ 基序并不能特异性地诱导ＴＩ Ｒ９表达上调。结合本实验结果， 可以间接地推测，人类ＡＰ能够诱导ＴＬＲ９快速而强烈的表达 上调。 ３．２早期ＡＰ患者外周血促炎细胞因子及抑炎细胞因子与 ＴＩ Ｒ９的关系ＴＬＲ９的上调和血清中一些细胞因子的增加是 密切相关的。以往的研究已经证实ＴＬＲ９的激活可以诱导促 炎症细胞因子，如Ｉｇ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ广１２和ＴＮＦ＿ｄ等的大量 释放 ］。作者对其中的两种，ＩＩ 一１和ＴＮＦ—ａ进行了检测；它 们在ＴＬＲ９上调后的某一特定时段都表现为上调。这一结果 间接支持作者关于ＴＩ Ｒ９参与了ＡＰ的推测。而且炎症时 ＴＬＲ９通路的具体作用靶点或最终的调节产物尚无定论，有理 由相信上述促炎细胞因子是其可能的下游产物。同时，为进一 步明确ＴＬＲ９为促炎症性因素，作者还对抑制炎症的细胞因子 ＩＬ一４进行了检测。结果表明，ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ表达在ＡＰ早期呈 逐渐上调的表现的同时，作为具有抑制炎症作用的细胞因子 ＩＬ一４的表达水平却在短暂上调之后维持于接近基线的水平， 这说明ＴＩ Ｒ９在人类ＡＰ的发生、发展中可能确实是一种单纯 的促炎性细胞介质。 ３．３ ＡＰ病情轻重及预后与ＴＩ Ｒ９的相关性 通过分析本组 ＡＰ患者的淀粉酶及脂肪酶走向与ＴＬＲ９ ｍＲＮＡ表达水平，可 以看出：在血清淀粉酶及脂肪酶浓度逐渐减低的时候ＴＩ Ｒ９ ｍＲＮＡ的表达水平是在继续上调的。结合前述的判断，ＴＩ Ｒ９ 在人类ＡＰ的发生、发展中是一种促炎性细胞介质，本研究可 以推测，ＴＩ Ｒ９的表达水平与人类ＡＰ的病情严重程度和预后 之间可能并没有一种必然的联系。 参考文献 Ｅｌｉ Ｚｅｎｇ ＹＪ，Ｓｏｎｇ ＪＭ，Ｌｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｉｓ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒａｔ ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｅｒｕｌｅｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｐａｎｃｒｅａｓ，２００８，３６：２１２—２１４． ６２５ Ｅ２］Ｗｅｉ Ｔ，Ｇｏｎｇ Ｊ，Ｒｓｓｌｅ ＳＣ，ｅｔ ａ１．Ａ ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ａｓ－ ｓｅｍｂｌｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＴＬＲ５—１０ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ＴＬＲ１１—１３ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｏｄｅｌ，２０１１，１７（１）：２７—３６． ［３］Ａｋｉｒａ Ｓ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，１５：５－１１． Ｅ４］Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｘｕ Ｌ，Ｑｉｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｗ Ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙ（ｐ－ｐｈｅｎｙ１ｅｎｅｖｉｎｙｌｅｎｅ）ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ：ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｓＤＮＡ［Ｊ］．Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１３，３４（５）：４４２— ４４６． ［５］Ｌｉｕａ Ｊ，Ｘｕａ Ｃ，Ｌｉｕ ＹＬ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ＴＩ Ｒ９ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＣｐＧ－ＯＤＮ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＴＬＲ９［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０１２，３５： ４４３－４５１． Ｅ６］Ｐａｎ Ｘ，Ｙｕｅ Ｊ，Ｄｉｎｇ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ １１ ｏｆ ＴＬＲ９ ｃａｎ ｔｉｇｈｔｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ＣｐＧ ＯＤＮ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉ— ｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１２，２８７（３６）：３０５９６—３０６０９． ［７］Ｋａｕｐｐｉｌａ ＪＨ，Ｋｏｒｖａｌａ Ｊ，Ｓｉｉｒｉｌ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｔｏｎｇｕｅ［Ｊ］．Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ， ２０１４，２３（２）：１０４—１０７． ［８］Ｋａｕｐｐｉｌａ Ｊ Ｈ，Ｋａｒｔｔｕｎｅｎ ＴＪ，Ｓａａｒｎｉｏ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－９ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ，２０１３，５ （５）：１６５９—１６６３． ［９］ｖａｎ Ｇｅｅｎｅｎ ＥＪ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｅｅｔ ＤＬ，Ｂｈａｇｉｒａｔｈ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｅｔｉｏｌ— ｏｇｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｂｉｌｉａｒｙ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１０，７（９）：４９５—５０２． ［１０］Ｎｉｊｍｅｉｊｅｒ ＲＭ，Ｓｃｈａａｐ ＦＧ，Ｓｍｉｔｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｌｏｂ— ａ１ ｆｘｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＦＸＲ ｌＯＣＵＳ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅ— ａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９（１２）：ｅｌ１４３９３． ［１１］Ｄｅｎｇ ＹＹ，Ｗａｎｇ Ｒ，Ｗｕ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｄｉｇ Ｄｉｓ，２０１４，１５（１０）：５７０—５７７． ［１２］Ｍｅｒｒｅｌｌ Ａ，Ｉｌｖｅｓａｒｏ ＪＭ，Ｌｅｈｔｏｎｅｎ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐ－ ｔｏｒ ９ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｍａ－ ｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６， ４（７）：４３７—４４７． ［１３］Ｘｕｅ Ｊ，Ｈａｂｔｅｚｉｏｎ Ａ．Ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ—ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ａ— ｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ｖｉａ ＴＬＲ４ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１４，１２４（１）：４３７—４４７． ［１４］ＬｉｎｄａｕＤ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｔｗｏｒｋ：ｍｙｅ— ｌｏｉｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｎａｔｕ— ｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１３８（２）：１０５—１１５． ｒ １ ５］Ｏｈｔｏ Ｕ，Ｙａｍａｋａｗａ Ｎ，Ａｋａｓｈｉ—Ｔａｋａｍｕｒａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｕｃ— ｔｕｒａ１ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ ｐｏｌｙｍｏｒ— ｐｈｉｓｍｓ Ｄ２９９Ｇ ａｎｄ Ｔ３９９Ｉ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１２，２８７ （４８）：４０６１１－４０６１７． （收稿日期：２０１４—１０—０８修回日期：２０１４—１２—１０）
