trim59在人肝癌细胞中表达变化及其对细胞增殖、p53蛋白表达的影响

辽宁大连116021 ；2中国人勤保障第九六七医院摘要：目的 观察三结构域蛋白59(TRIM59)在人肝细胞癌(HCC)细胞中的表达变化，及其对细胞增殖和p53 蛋白表达的影响。方法 选取6种HCC细胞系(Huh7、Hep3B、HepG2、SK-Hepl、BEL7402、SMMC7721)及人正常肝

细胞系LO2为研究对象，采用qRT-PCR和Western blotting法分别检测细胞中的TRIM59 mRNA和蛋白，选择预实 验中TRIM59 mRNA和蛋白表达水平相对较高的HCC细胞进行下一步实验。将HepG2细胞分为shTRIM59组和

shControl组,shTRIM59组感染TRIM59慢病毒,hControl组转染TRIM59慢病毒阴性对照。将Huh7细胞分为pcD- NA3.1-TRIM59 组和 pcDNA3. 1-Vector 组，分别转染 pcDNA3.1-TRIM59 质粒和 pcDNA3. 1-Vector 对照质粒。采用集

落形成实验检测HepG2、Huh7的细胞增殖能力，采用Western blotting法检测细胞中的p53蛋白。结果 各HCC细 胞中TRIM59 mRNA及蛋白相对表达量均高于L02细胞，HepG2及Huh7细胞中TRIM59的表达高于其他HCC细 胞系(P均＜0.05)。shTRIM59组HepG2细胞集落形成数低于shControl组，p53蛋白相对表达量高于shControl组

(P均＜0.05 )o pcDNA3. 1-TRIM59组Huh7细胞集落形成数高于pcDNA3. 1-Vector组,53蛋白相对表达量低于

pcDNA3.1-Vector组(P均＜0.05)。结论 HCC细胞中TRIM59 mRNA及蛋白高表达;上调TRIM59表达,HCC增

殖能力增强,53蛋白低表达，下调TRIM59表达则HCC增殖能力减弱,53蛋白高表达;TRIM59对HCC细胞增殖

的影响 通 节p53 实现的。关键词:TRIM59基因;肝癌细胞;细胞增殖;53蛋白

doi：10. 3969/j. issn. 1002-266X. 2020. 08. 011

中图分类号:R735.7 文献标志码:A 文章编号：1002-266X( 2020) 08-0044-04Expression of TRIM59 in hepatocellular carcinoma cells and its effect on cell proliferation and p53 protein expressionLU Guanghui , SUN GangLIU Ziyuan, XU PengSHAO RundongCHEN QiBAO Fengyu, , , , 1 The No. 967 Hospital of PLA Joint Logistics Support Force, Postgraduate TrainingBase of Jinzhou Medical University, Dalian 116021, ChinaAbstract： Objective To observe the expression of tripartite-motif 59 ( TRIM59) in the human hepatocellular carci­

noma ( HCC) cells and its effect on cell proliferation and p53 expression. Methods Six kinds of HCC cell lines ( Huh7，

Hep3 B，HepG2，SK-Hep1 ，BEL7402，SMMC7721 ) and human normal liver cell line LO2 were selected as subjects. The

expression of TRIM59 mRNA and protein in experimental cells were detected by Western blotting and qRT-PCR. HCC cells

with relatively high levels of TRIM59 mRNA and protein expression were selected for the next experiment. HepG2 cells

were divided into two groups： the shTRIM59 group which was transfected with TRIM59 lentivirus and the shControl group

which was transfected with lentivirus negative-shRNA. Huh7 cells were divided into the pcDNA3. 1 -TRIM59 group and

pcDNA3. 1-Vector group，and were transfected with pcDNA3. 1-TRIM59 plasmid and pcDNA3. 1-Vector control plasmid，

respectively. Cell proliferative capacity of HepG2 and Huh7 cells were detected by colony formation experiment and the ex­

pression of p53 protein was detected by Western blotting. Results The relative expression levels of TRIM59 mRNA and protein were higher in the HCC cell lines than in the human normal liver cell line LO2. The expression of TRIM59 in

HepG2 and Huh7 cells was higher than that of the other HCC cell lines ( P ＜ 0. 05) . The shTRIM59 group had a smaller

number of colony formation than the shControl group in HepG2 cells，and had a higher relative expression of p53 protein

than the shControl group ( both P ＜ 0. 05) . The pcDNA3. 1-TRIM59 group had a higher number of colony formation than

the pcDNA3. 1-Vector group in Huh7 cells，and had a lower relative expression of p53 protein than the pcDNA3. 1-Vector通信作者:孙纲(E-mail: neomoon@ yeah. net)

44山东医药2020年第60卷第8期group ( both P <0.05). Conclusions TRIM59 mRNA and protein are highly expressed in the HCC cells. When TRIM59 is up-regulated in HCC cells， the cell proliferative capacity is enhanced， and the expression of p53 decreases； when

TRIM59 is down-regulated， the cell proliferative capacity is weakened， and the expression of p53 increases. The effect of TRIM59 on HCC cell proliferation might be achieved by regulating p53 expression.Key words： TRIM59 gene； hepatocellular carcinoma cells； cell proliferation； p53 protein人肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，

发病率逐年增加曾。我国每年约36.9万人死于

肝癌曾勺占全球肝癌死亡病例总数的47. 2%。由于 缺乏早期敏感的诊断标志物及方法,HCC通常于晚 期确诊，预后不良，患者5年生存率低于7%⑷。因

［］GAA-3',下游引物序列为 5'-ACGGGTTGAACCT- CAGGAAG-3'PCR 反应条件为 95 C 1 min ,95 C 30 s、55 C 30 s、72 C 1 min，

30

。 实验o 复3次。目标基因的表达针对内参基因house keep­

ing 水平进行标准化，表示TRIM59 mRNA相对表达

此，如何更好地明确HCC发生的分子机制、寻找早

期诊断方法、改进治疗方案是相关研究的重点。三

结构域蛋白59(TRIM59)是一种存在于不同肿瘤细 胞中的新型生物标志物［5~8］，其具有高度结构稳定

性及广泛的生物学活性。TRIM59被认为是一种癌

基因,TRIM59的过表达可能参与细胞中一些致癌基 因的突变，导致恶性肿瘤发生、发展⑼。关于

TRIM59在HCC细胞中的作用及功能，目前国内外

文献报道尚少。2018年12月~2019年2月，本研

究观察了 TRIM59在不同HCC细胞中的表达变化, 及其对细胞增殖、53蛋白表达的影响，探讨可能的

分子机制。1材料与方法1.1

细胞与主要实验材料 6种HCC细胞系

(Huh7, Hep3B, HepG2, SK-Hep1、BEL7402、

SMMC7721 /及人正常肝细胞系L02均购自ATCC

公司。细胞培养基 RPMI-10、EMEM、DMEM、10% 胎牛血清购自GIBCO公司。1%青霉素-链霉素购

自Beyotime公司。小鼠E17 cDNA文库来自Clon- tech实验室。脂质体3000购自Invitrogen公司。抗 TRIM59及TRIM59的慢病毒颗粒购自Santa Cruz公

司。pcDNA3. 1-TRIM59 质粒和 pcDNA3. 1-Vector 对

照质粒购自Gene Copoeia公司。普罗霉素购自Sig­

ma 公司。抗 p53 和 GAPDH 购自 Cell Signaling Technology 公司。RNeaseMini 试剂盒购自 QIAGEN

公司。SsoFastEvaGreen超级混合物、增强化学发光 系统购自Bio-Rad公司。裂解缓冲液购自Roche

公。1.2 HCC细胞与正常肝细胞中TRIM59 mRNA及

蛋白检测 用RNeaseMini试剂盒从细胞中提取总

RNAo 采用 qRT-PCR 法检测 TRIM59 mRNA。PCR 反应体积.10 iL,包括SsoFast EvaGreen超级混合物 5 iLDNA模板1咽、两对引物各1 iLo TRIM59

mRNA 上游弓| 物序列为 5'-TACGAGAGCAGCTG-量，实验重复3次。采用Western blotting法检测 HCC细胞系及正常肝细胞中的TRIM59蛋白，以

GAPDH为内参。实验重复进行3次，使用Image J

软件进行图像处理,分析灰度值。1.3 TRIM59对HCC细胞增殖及p53蛋白表达影

响观察1.3. 1细胞分组与转染 选择预实验中TRIM59

mRNA和蛋白表达水平相对较高的HepG2、Huh7细

胞系进行实验。将HepG2细胞分为shTRIM59组和

shControl 组，shTRIM59 组感染 TRIM59 慢病毒,

shControl组感染TRIM59慢病毒阴性对照。将 Huh7 细胞分为 pcDNA3.1-TRIM59 组和 pcDNA3.1-

Vector组;采用,PCR法从小鼠E17 cDNA文库中扩

增TRIM59将含有TRIM59 cDNA的片段亚克隆到

pcDNA3. 1质粒上；用脂质体3000将pcDNA3. 1- TRIM59质粒和阴性对照分别导入至pcDNA3. 1-

TRIM59 组和 pcDNA3.1-Vectoro 组 Huh7 细胞。感染

或转染后继续培养48 h提取各实验组总RNA和

蛋白。采用Western blotting法检测TRIM59蛋白。

shTRIM59 组、shControl 组的 HepG2 细胞中, TRIM59

蛋白相对表达量分别为 0.46 ±0.061.03 ±0.02(P <0.05)opcDNA3. 1-TRIM59 组、pcDNA3. 1-Vector

组的 Huh7 细胞 TRIM59 对

分别为0.60 ±0.01,0. 13 ±0.01 (P <0.05)表明两种细

胞均感 转 。1.3.2细胞增殖能力检测取感染或转染后的两

种HCC细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，按1 x 103/

孔平铺于6孔板内，于37 C、5% CO2条件下在完全

培养基中培养。每3 d更换1次培养基，约14 d后

形成肉眼可见的细胞集落(每个集落M50个细胞)

用0.1%结晶紫染色,光学显微镜下计算集落形成 数,表示细胞增殖能力。实验重复进行3次，使用

Image J 进 图 像处理。1.3.3 p53蛋白检测 当两种HCC细胞融合率达45山东医药2020年第60卷第8期到90%时，提取总蛋白，并用Bradford法进行鉴定。

用聚丙 胺电泳分

，转膜之后，将纤维，4七

,TBST洗膜素滤膜(NC)与一抗共同 3

。加入二抗，室

1 h,TBST 膜3次。ECL 液显影，以GAPDH为内参。实验重复进

行3 ，采用Image J 分 条 度值。1.4

学方法 采用SPSS17.0 。计量分析和以x±s ，组 采用单因素

t检验。P <0.05为差异有 学 。2 结果2.1

HCC细胞、正常肝细胞中TRIM59 mRNA及蛋

白表 达比较 BEL7402Hep3 BHepG2Huh7、

SMMC7721、SK-Hep1、LO2 细胞中 TRIM59 mRNA 相

:A 为 shControl 组；B 为 shTRIM59 组；C 为 pcDNA3. 1-Vector

、、、对表达量分别为 10. 86 ±0.97,8.74 ±0.23,62.41

±7.53、63. 99 ±5. 91,30. 51 ±3. 21、9. 99 ±0. 20,

组;D 为 pcDNA3.1-TRIM59 组。图1 TRIM59表达对HepG2、Huh7细胞增殖能力的影响0.03 ±0.01,TRIM59蛋白相对表达量分别为0. 14 ±0.01,0.13 ±0.02,0.68 ±0.04,0.72 ±0.03,0.33 ±0.02、0. 12 ±0. 02,0. 00 ±0. 01,各 HCC 细胞中

HCC早期无典型临床 ，恶性度高、转移率高、复细胞先天或后天的高， 经确诊就已发展为进展性，错过时期。加之部分

TRIM59 mRNA及 对表达量均高于L02细胞了

,

(P均<0.05)。在6种HCC细胞系中,HepG2细胞 TRIM59 mRNA 及 对

均高于 BEL7402、对

经规范化手 合术后化疗后预后仍不乐观［1,2］。从分子生物学层面 IHCC的

Hep3B、SMMC7721、SK-Hep1 细胞(P 均 < 0. 05 / ； Huh7 细胞 TRIM59 mRNA 及

机制，寻找更有效的 法尤为重于 BEL7402Hep3 BSMMC7721SK-Hep1 细胞P

均<0.05 )o选取HepG2细胞及Huh7细胞为

、、, 均高(要。作为一种新发现的癌基因,TRIM59有着典型的 RBCC 域，即从N端到C端依次为锌 域 (RING finger)、B-BOX 结构域、卷曲螺旋(Coiled-

阶段的实验细胞。2. 2 TRIM59对HepG2、Huh7细胞增殖能力的影响 shControl组、shTRIM59组HepG2细胞集落形成

coil)结构域［13］,被证明 于不同的 细胞中,参 少 道。细胞增殖、转移和侵袭的［4\"6］。但是,TRIM59在HCC中的表达情况及具体作用机制

数分别为(137.00 ±2.65 ),(57. 67 ±2.01、个,hT- RIM59组集落形成数低于shControl组(P <0.05)。

显示，与正常肝细胞相比,HCC细

胞中TRIM59 mRNA高表达。上调HepG2细胞中 TRIM59 后,HCC细胞的增殖能力明显增强；降Huh7 细胞 TRIM59 后，细胞增殖 力明显

pc DNA3.1-Vector 组、pcDNA3. 1-TRIM59 组 Huh7

细胞集落形成数分别为(87.67 ±2.52),150.33 ±

1.15、个,pcDNA3. 1-TRIM59组集落形 高于

pcDNA3.1-Vector 组(P 均 <0.05)。见图 1。。由此 的增殖。,TRIM59高 有利于HCC细胞2.3 TRIM59对HepG2、Huh7细胞中p53蛋白表达

的影响 shControl 组、 shTRIM59 组 HepG2 细胞

p53蛋白相对表达量分别为0. 71 ±0.05、1.32 土 0. 06 ,shTRIM59组p53蛋白相对表达量高于shCon­

为进一步探究TRIM59对HCC细胞的作用机

制，我们查阅相关文 ，TRIM59 胃癌细胞中促进p53的 素化和降解［17］,从而使p53 去了trol 组P < 0. 05 ()o pcDNA3. 1-Vector 组、pcDNA

分对细胞增殖的抑制而导致胃癌;TRIM59可通过对

3.1-TRIM59组Huh7细胞中p53蛋白相对

别为 0.93 ±0.02,0.77 ±0. 03,pcDNA3. 1-TRIM59

导 些 细胞的增殖和侵袭［8,9］。而在HCC细胞中，TRIM59能否对p53 p53的素化和降

组p53蛋白相对表达量低于pcDNA3.1-Vector组(P <0.05 )o的 产生影响仍不明确。 TRIM59 HCC细胞中的

,探讨TRIM59的作通 节3讨论HCC在肝脏疾病中占有相当一部分比例［0］。46用及与p53的关系。 显示，上调Huh7细胞中TRIM59表达后,53表达水平明显下调;而下

山东医药2020年第60卷第8期调HepG2细胞中TRIM59表达后,53表达水平显 著上调。这表明干预HCC细胞中TRIM59的表达 后,p53的表达可相应发生改变，提示TRIM59可能

通过调节p53信号通路进而对HCC细胞产生影响。p53作为一种广泛存在于机体细胞中的抑癌基

[5] Liu Y, Dong Y, Zhao L, et al. TRIM59 overexpression correlates

with poor prognosis and contributes to breast cancer progression

(12)：1792-1802.[6] Wu W, Chen J, Wu J, et al. Knockdown of tripartite motif-59 in­

through AKT signaling pathway J . Mol Carcinog201857

[ ], ,因，可通过对细胞周期进程的阻断和促使细胞凋亡

来有效抑制肿瘤细胞的生长，阻遏恶性肿瘤的进 展囱。人类MDM2同源基因是一种可在多种肿瘤

细胞中高表达的E3泛素连接酶,它能与p53结合

[J]. Oncol Rep, 2017,38(4) ：2480-2488.[7] Hu SH, Zhao MJ, Wang WX, et al. TRIM59 is a key regulator of

growth and migration inrenal cell carcinoma [J] . Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) , 2017,63(5) ：68-74.[8 ] Sun Y, Ji B , Feng Y, et al. TRIM59 facilitates the proliferation of

colorectal cancer and promotes metastasis via the PI3K/AKT path­hibits the malignant processes in human colorectal cancer cells

并辅助p53在肿瘤细胞中发生降解,被认为是调节

p53降解最重要的一种泛素连接酶，是p53的抑制

因子。从分子结构来看，在降解p53的过程中，

MDM2的RING结构域起到了主要作用，而TRIM59

在其N末端也有着类似的RING结构域，这种结构 相似性表明TRIM59和MDM2在对p53的中可

能也有着类似的机制。因此推测，在HCC中 TRIM59的RING结构域可能与p53存在着某种关， 促使 p53 生降 。 高 的 TRIM59 通

过上述途径降解p53 ,53低表达失去对HCC细胞 的抑制作用而导致肿瘤细胞生长；相反曾氐表达的

TRIM59不足以降解p53,p53高表达肿瘤细胞

增殖、抑制了 HCC的进展。综上所述，HCC细胞中TRIM59 mRNA及蛋白

高表达;上调TRIM59表达,HCC增殖能力增强、p53

低表达，下调TRIM59表达则HCC增殖能力减弱、

p53高表达；TRIM59对HCC细胞增殖的影响可能

是通过调节p53表达实现的。具体影响机制仍有待

进一步研究。参考文献：[1 ] Mcglynn KA, London WT. The global epidemiology of hepatocellu­

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