维普资讯 http://www.cqvip.com ・２０ｏ・ 世界感染杂志２００７年第７卷第３期ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎＶｏｌｕｍｅ ７，Ｎｕｍｂｅｒ ３，Ｊｕｎ ２００７ 文章编号：１５６２—３１２２（２００７）０３—０２００—０３ 术论著术 蓝藻抗病毒蛋白Ｎ全长基因原核表达克隆的构建 庞峰，于红 摘要：目的构建蓝藻抗病毒蛋白（ＣＶ－Ｎ）全长基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法根 据Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ中ＣＶ－Ｎ的全基因序列，人工合成ＣＶ－Ｎ序列，进行ＰＣＲ扩增。将扩增的ＰＣＲ产物经双 酶切后，克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）上，构建重组表达载体ｐＥＴ３０ａ—ＣＶ－Ｎ。重组质粒经核苷酸 测序鉴定后，转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）诱导表达目的蛋白。结果ＣＶ－Ｎ基因可在大肠杆菌中高效表 达，重组蛋白相对分子质量为ｌｌＫｄ，以包涵体形式存在。结论成功地构建了ＣＶ—Ｎ原核表达载体， 为ＣＶ—Ｎ的纯化及其抗病毒的活性研究奠定了基础。 关键词：蓝藻抗病毒蛋白Ｎ；基因；原核表达 中图分类号：Ｒ３７３．９ 文献标识码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｌｏｎ ｏｆ Ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ－ｎ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｅ ＰＡＮＧ Ｆｅｎｇ，ＹＵ Ｈｏｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，２６６０２１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ—Ｎ（ＣＶ—Ｎ）ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ＣＶ—Ｎ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，ｔｈｅ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｎａｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ３０ａ（＋）ｖｅｃｔｏｒ．ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＥＴ３０ａ（＋）一ＣＶ－Ｎ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｈｔ ＩＰＴＧ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｐＥＴ３０ａ（＋）一ＣＶ－Ｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｕｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ａ １ １ＫＤ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎ Ｅ．Ｃｏｌｉ，ａｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｔｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｒｓｅａｒｃｈ ｎａｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣＶ－Ｎ ａｓ ａｎ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ—Ｎ：Ｇｅｎｅ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １９９７年，Ｂｏｖｄ等…首次报道了从蓝藻椭孢念珠 １．１材料 藻提取物中发现的一种具有抗ＨＩＶ活性的多肽类物 １．１．１实验试剂Ｔａｑ酶、Ｔ４连接酶、ＩＰＴＧ，丙烯 质，命名为ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ—Ｎ（ＣＶ—Ｎ），国内学者试译 酰胺及亚甲基双丙烯酰胺，低分子量标准蛋白，Ｎ， 为蓝藻抗病毒蛋白一Ｎ。研究表明，ＣＶ－Ｎ不仅能够有 Ｎ’一四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）购自上海生工生物工 效地抑制多个亚型的人类免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ＿１）、 程技术公司，ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ购自ＴａＫａＲａ公司，常用试剂 ２（ＨＩｖ＿２）、猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶ），而且对单纯 为国产或进口分析纯。宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）及质粒 疱疹病毒、流行性感冒病毒及其它一些包膜病毒也 ｐＥＴ３０ａ（＋）由本室保存。 有抑制作用【 ４】。我们运用ＤＮＡ重组技术，构建了 １．１．２ ＣＶ—Ｎ基因序列与ＰＣＲ引物ＣＶ—Ｎ基因序列 ＣＶ—Ｎ基因的原核细胞表达克隆，并成功地表达了 由上海生工公司人工合成ＣＶ—Ｎ序ＹｌＪ３０３ｂＰ。ＰＣＲ引 ＣＶ—Ｎ，为今后获得纯化的ＣＶ—Ｎ及其抗病毒活性的 物由上海生工生物工程技术公司合成。 研究奠定了良好的基础。 １．２方法 ｌ材料和方法 １．２．１目的基因合成及ＰＣＲ扩增根据ＧｅｎｅＢａｎｋ 收稿日期：２００７．０３．２６；修回日期：２００７．０４．１２ 中ＣＶ－Ｎ的全基因序列人工合成ＣＶ－Ｎ序列３０３ｂｐ。 作者单位：青岛大学医学院微生物学教研室，山东青岛２６６０２１ 在两端插入酶切位点及保护碱基。ＰＣＲ上游引物为 作者简介：庞峰（１９８２．），男（汉族），山东省青岛市人，青岛大学医 学院研究生，硕士学位．主要研究方向：海洋生物活性物质抗病毒作 ５’ＧＧＧ ＴＣＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＧＧ ＴＡＡ ＡＴＴ ＣＴＣ ＣＣＡ 用机制。 ＧＡＣ ＣＴＧ Ｃ ３’；下游引物为５’１ＴｒＣ ＧＧＧ ＣＩＴＴＧＴ 通讯作者：于红（１９６６．），女（汉族），山东省青岛市人，中国海洋大 学博士研究生，博士学位，教授，硕士生导师．主要研究方向：海洋 ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＡＴ ３’。ＰＣＲ反应体系为ＤＮＡ 生物活性物质抗病毒作用机制。 ２１ＸＬ，Ｔａｑ酶２Ｕ，１０Ｘ ｄＮＴＰ ３儿，２５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣ１２ 维普资讯 http://www.cqvip.com 世界感染杂志２００７年第７卷第３期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｎｕｍｂｅｒ ３，Ｊｕｎ ２００７ ・２０１・ １．８ ，１０×ＰＣＲ缓冲液３儿，总体积为３Ｏ 。ＰＣＲ 反应条件：预变性９４℃５ｍｉｎ，９４ ｏＣ ｌｍｉｎ￣５３ ｏＣ ２．２ ＣＶ－Ｎ的表达ＳＤＳ．ＰＡＧＥ图谱显示含重组克 隆的诱导菌在相对分子量１ｌｋＤ处出现蛋白条带， ｌｍｉｎ￣７２℃ｌｍｉｎ，３０个循环，反应结束前７２￣Ｃ延 伸１０ｍｉｎ。经扩增后，ＰＣＲ产物行１．２％琼脂糖电泳 检测。 而未诱导的重组菌在相对位置无蛋白条带，与理论 预测值相一致。另外，从蛋白带型看，３Ｏ℃诱导６ｈ， ８ｈ及３７℃诱导６ｈ时蛋白表达量最高，详见图１。 １．２．２ ＣＶ－Ｎ重组克隆的构建将扩增的ＰＣＲ产物， ３讨论 ￣ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ双酶切后与ｐＥＴ３０ａ（＋）载体连接， 以ＴＳＳ法转化感受态大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑选阳 ＣＶ．Ｎ具有结合ｇｐｌ２０性质和抗ＨＩＶ的特性使 其成为抗病毒的研究热点Ｌ２Ｊ。Ｂｏｌｍｓｔｅｄｔ等发现ＣＶ－Ｎ 性克隆，同时设ｐＥＴ３０ａ（＋）阴性对照及空白对照。 碱裂解法小量制备质粒ＤＮＡ，送至上海生工生物工 程技术公司进行序列鉴定。 １．２．３ ＣＶ－Ｎ重组克隆表达的诱导 挑取新鲜的单 个重组菌落，接种于含５Ｏ ，ｍＬ卡那霉素的ＬＢ液体 培养基中，３７￣Ｃ振荡过夜培养，至Ａ６０ｏ为０．６，取ｌｍＬ 菌液作为诱导前对照，继续诱导培养。分别以不同 浓度的ＩＰＴＧ（Ｏ．５ｍＭ及ｌｍＭ ＩＰＴＧ）于不同温度（３０ ℃及３７ ｏＣ）诱导。分别于诱导后２ｈ，４ｈ，６ｈ，８ｈ收 集菌液，５０００ｇ离心１０ｒａｉｎ获取细菌沉淀Ｌ５】。细菌沉 淀加入１×ＳＤＳ￣Ｈ样缓冲液煮沸１０ｒａｉｎ，取ｌ５儿行 １２％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳检测诱导表达情况【６】。同时设 ｐＥＴ３０ａ（＋）空载体转化宿主菌阴性对照及未诱导 ｐＥＴ３０ａ（＋）．ＣＶ－Ｎ样品对照。 ２结果 ２．１ ＣＶ．Ｎ重组克隆的鉴定经上海生工生物工程 技术公司核苷酸测序证实与天然ＣＶ．Ｎ序列相同，测 定结果见附件图Ｉ，证明重组克隆成功。 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ Ｍ ６６ＫＤ ４５ＫＤ ３５ＫＤ ２７ＫＤ ２０ＫＤ １４．４ＫＯ ９ ５ＫＤ ６．５ＫＤ ①诱￣－ｐＥＴ３０ａ（＋）６ｈ：②未诱导ｐＥＴ３０ａ（＋）一ＣＶ－Ｎ③～⑥３０℃诱导 ｐＥＴ３０ａ（＋）一ＣＶ－Ｎ２ｈ，４ｈ，６ｈ，８ｈ：７．３７＂Ｃ诱导ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＣＶ－Ｎ样品６ｈ Ｍ 低分子量标准蛋白 图１ 重组蛋白的ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ电泳图谱 １，Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐＥＴ３０ａ（＋）６ｈ，２，ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＣＶ－Ｎ；３－６，３０￣Ｃ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＣＶ－Ｎ２ｈ，４ｈ，６ｈ，８ｈ；７．３７＊Ｃ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＣＶ－Ｎ ｓａｍｐｌｅ６ｈＭｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔａｎｄａｒｄｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｉｇｕｒｅ １ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ 能结合在单纯疱疹病毒．１（ＨＳＶ－１）上并抑制其活 力［７】；Ｏ、Ｋｅｅｆｅ等研究表明ＣＶ－Ｎ对流感病毒Ａ型 和Ｂ型都具有很高的抗病毒活性Ｌ８】；Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ等证 实ＣＶ－Ｎ能结合在埃博拉（Ｅｂｏｌａ）病毒表面糖蛋白 ＧＰ１．２上抑制埃博拉病毒的感染 】。ＣＶ－Ｎ不仅具有 广谱的抗病毒活性，高稳定和低毒性也是其作为新 一代多肽类抗病毒药物的优势所在。ＣＶ－Ｎ的若干 特性使其有可能成为一种非常有价值的潜在新型抗 病毒药物。 目前ＣＶ．Ｎ主要从椭孢念珠藻中分离纯化制 得，但椭孢念珠藻养殖困难，因此从椭孢念珠藻中 分离纯化ＣＶ．Ｎ不仅成本高、工艺复杂，而且原料 浪费严重，借助基因工程技术生产ＣＶ．Ｎ已成为当 前所需。早在ＣＶ－Ｎ发现之初，Ｂｏｙｄ等人工合成了 ＣＶ－Ｎ序列，经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＦＬＡＧ质粒上， 构建成分泌型表达载体，并在Ｅ．Ｃｏｌｉ中诱导表达成 功…。但该表达产物是一系列完整蛋白和缺失Ｎ端 前２个残基的蛋白混合物，系一种难以处理的融合 蛋白，去除ＦＬＡＧ后发现融合蛋白中仍含有ｏｍｐＡ 信号肽序列，从而产生了截短蛋白，成为低活性的 ＣＶ－Ｎ形式。１９９８年，Ｍｏｉｌ等在此基础上使用了一 种可交换型的分泌肽，并在ｐＥＴ－２６ｂ（＋）载体中表 达，得到了大量纯化的ＣＶ－Ｎ，ＥＳＩＭＳ分析和Ｎ端 的序列测定证明与天然ＣＶ－Ｎ的结构相同，并且具 有抗ＨＩＶ活性。但上述方法均存在表达产量偏低的 问题，每升高密度细胞培养物中经ＨＰＬＣ纯化的 ＣＶ－Ｎ仅为１０ｍｇ，尚不能满足其抗病毒活性研究的 需要。 本实验成功构建了融合表达质粒ｐＥＴ３０ａ（＋） 。ＣＶ．Ｎ，经反复实验优化确定了最佳的诱导方案。 为以后获得纯化的ＣＶ．Ｎ融合蛋白及其抗病毒活性 的研究打下了基础。 参考文献： 川 ＢｃＩｙｄ ＭＲ，Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ ＫＲ，ＭｃＭａｈｏｎ ＪＢ，ｅｃ ａ１．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ－Ｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ 维普资讯 http://www.cqvip.com ・２０２・ 世界感染杂志２００７年第７卷第３期ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎＶｏｌｕｍｅ ７，Ｎｕｍｂｅｒ３，Ｊｕｎ２００７ 蚓 蜘 （上接第１９０页） 的流行病学效果评价【Ｊ１．中国计划免疫，１９９８，４（３）：１５４—１５６． 【２７］ 陈沽，陈深侠，凌罗亚，等．国产麻疹流行性腮腺炎风疹联合疫 苗初免效果及免疫程序探讨【Ｊ１．中国计划免疫，２００６，１２（３）： ２１５—２１７． 刘淑勤，黄跃红，陈秀芬．不同毒株制备的腮腺炎疫苗的免疫效 果分析【Ｊ１．华南预防医学，２００５，３１（３）：３９—４２ 施燕，胡家瑜，汤素文，等．上海市麻疹、流行性腮腺炎、风疹 抗体水平调查分析【Ｊ１．上海预防医学杂志，２００４，１６（８）：３７８—４１１． 马绍辉，张蓉松，刘龙丁，等．腮腺炎病毒分离株（ＳＰ株）ＳＨ 基因及其旁侧序列的初步研究分析【Ｊ１．微生物与感染，２００６，１ （２）：８７．９ｏ． 【２８】 陆祖添，颜少芬，黄志碧．一起小学生流行性腮腺炎爆发调查 【Ｊ１．中华流行病学杂志，２００３，２４（１）：６９． 【２９］ 陈庆．流行性腮腺炎疫苗流行病学效果观察与分析【Ｊ１．安徽预防 医学，２００３，９（６）：３７３—３７４． 徐福根，黄志成，黄诚孝．流行性腮腺炎免疫策略探讨【Ｊ１．浙江 预防医学，２００１，１３（８）：１－２． （上接第１９９页） 【３】 陈仕珠．新生几和儿童乙肝免疫【Ｊ１．世界华人消化杂志，２００６， １４（２７）：２７０８．２７１２． ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｌｌ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｃｈｅｄｕｌｅ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００５，１ １（７）：１０３７—１０３９． Ｗｒｉｇｈｔ Ｎ Ｍ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｔ Ｌ，Ｔｏｍｐｋｉｎｓ Ｃ Ｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ 【４】 陈仕珠．重点、高危和特殊人群之乙肝免疫【Ｊ１．世界华人消化杂 志，２００６，１４（２７）：２７１３．２７１７． ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｄ ｈｅｐａｔｅｉｉｔｓ Ｂ ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ ｆｏｒ ｈｏｍｅｌｅｓｓ ｄｒｕｇ ｕｓｅｒｓ［Ｊ１．Ｃｏｍｍｕｎ Ｄ Ｐｕｂｌｗ Ｈｅａｌｔｈ ２００２，５（４）： ３２４—３２６（１２５６４２５１）． Ｓｏｒｏｏｓｈ Ｓｈｏｋｒｉ Ａｚｉｚｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｄｕｌｔ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ ａｎｄ 【５】 陈仕珠，张晋红，张增平，等．常规和快速乙肝免疫接种效果比 较【Ｊ１．世界华人消化杂志，２００６，１４（１９）：１８８４—１８８８． 【６】 陈仕珠．乙型肝炎病毒疫苗免疫现状及存在的问题【Ｊ１．世界华人 消化杂志，２００６，１４（２７）：２６６１－２６６７． 【７】 陈仕珠，韩永战．影响乙肝疫苗免疫效果的因素【Ｊ１．世界华人消 化杂志，２００６，１４（２７）：２７０１—２７０７． 【８】 Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ａ，ＳａｎＵ＇ａ Ａ，Ｈａｂｉｂｕｌｌａｈ Ｃ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎ ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ￣ｈｅｐａｔｉｉｆｓ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｍｉｘｅｄ ｏｐｕｌａｔｐｉｏｎ： ｎｏｎｒｅｓｏｎｄｅｒｓｐ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｉｔｓ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ１．Ｓｃａｎｄ Ｊ ＩｍｍｕｎｏＬ ２００３，５７（５）：４２３－４３１（１２７５３４９３）． Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ Ｌ，Ａｌｂａｒｒｎ Ｂ，Ｓａａｌｍｅｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，３２６（１）：２０－２８（１５２６２４９１）．
