肠膜明串珠菌BD3749亚种水平的鉴定及其生长特性研究

鄢明辉

【摘 要】对肠膜明串珠菌BD3749进行亚种水平的鉴定,探索其在食品工业中的应用前景。利用分子生物学及生化鉴定的手段对高产胞外多糖的肠膜明串珠菌BD3749进行了亚种水平上的鉴定;通过测定其在番茄汁培养基中生长过程的OD595、p H值动态变化以及对其中蔗糖的利用来评价其生长状况;通过对其生长过程中的胞外多糖产量的分析评价其发酵产物作为膳食补充剂的潜力;使用不同装液量培养模拟不同的氧压力强度,研究氧胁迫强度对胞外多糖产量的影响,并据此对其产胞外多糖的条件进行了优化。经鉴定BD3749为肠膜明串珠菌肠膜亚种,属于食品中可以使用的菌株。在此基础上研究了该菌株在番茄汁中的发酵及产胞外多糖性能,BD3749在番茄汁培养基中生长旺盛,其合成的胞外多糖主要为不溶性多糖。通过不同装液量发酵实验考察了通氧量对BD3749不溶性多糖产量的影响,并对BD3749在番茄汁培养基中的产多糖量进行了初步优化,在优化条件下,不溶性多糖的产量可达14.5 g/L。BD3749属于食品中可以使用的肠膜明串珠菌肠膜亚种,其能以番茄汁为基质生长并合成大量胞外多糖,在食品工业中具有重要应用价值。 【期刊名称】《食品科学技术学报》 【年(卷),期】2017(035)004 【总页数】7页(P42-48)

【关键词】肠膜明串珠菌;胞外多糖;亚种鉴定;番茄汁;不溶性多糖;膳食补充剂 【作 者】鄢明辉

【作者单位】光明乳业股份有限公司乳业研究院乳业生物技术国家重点实验室/上海乳业生物工程技术研究中心,上海200436 【正文语种】中 文 【中图分类】TS252.1

肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)是一类重要的乳酸菌[1-2]，因其优良的发酵性能以及能够产生特殊风味物质的特性[3]在食品中得到广泛应用[4-8]。在乳品工业领域，肠膜明串珠菌也是一种重要的发酵剂，例如，肠膜明串珠菌在奶酪成熟过程中发挥重要作用，并且为奶酪贡献了特殊风味[3, 5]。此外，肠膜明串珠菌在其他类型的乳制品中的应用也日渐成熟[5, 9-10]。

肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)是肠膜明串珠菌的一个亚种，被我国卫生部(卫生部公告2012年第8号)与美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)列为安全可食用菌种之一[11]。本实验室前期工作中从传统发酵泡菜中分离到一株高产胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)的肠膜明串珠菌BD3749(CGMCC100)，初步研究表明，其EPS受环境中氧的[12]，在优化条件下其产量可达31 g/L。与此前分离到的肠膜明串珠菌菌株不同[2, 5, 13]，该菌株特异性地合成不溶性EPS并介导形成由菌体、EPS及其他胞外物组成的复合结构[12]。BD3749合成的EPS结构已经得到初步解析，主要为高分子量葡聚糖[12, 14]。已有研究发现，该葡聚糖不被人体消化吸收，但能特异性地促进某些有益菌的增殖，因而有望作为新型的、具有益生特性的膳食补充剂[15-16]。

番茄汁作为一种低成本的培养基在科研及食品工业领域得到越来越多的重视。其具有来源广泛、成本低廉、天然安全等特点；同时富含多种维生素及膳食纤维，更有

番茄红素等抗氧化成分。因此，随着研究的深入，以番茄汁为基础介质的食品形式不断丰富[17-20]。这些产品在降低物料成本的同时，提高了食品的安全性，并有利于产品及其品质的标准化和工业大规模生产的成本控制。此前的研究表明，一些明串珠菌菌株在番茄汁培养基中能够实现良好生长，并且当蔗糖充足时能够产生大量EPS[13, 21]。因此，我们期望利用BD3749产生大量EPS的特征来研制一类基于番茄汁介质的食品。 1.1 材料与试剂

菌种：肠膜明串珠菌BD3749(中国普通微生物菌种保藏中心编号CGMCC100)由乳业生物技术国家重点实验室提供。

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉10 g，葡萄糖20 g，吐温80 1g，K2HPO4 2 g，乙酸钠5 g，柠檬酸三铵2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， MnSO4·4H2O 0.05 g，蒸馏水定容至1 L。

番茄汁培养基：由市场购得新鲜番茄，榨汁后，将所得液体过滤煮沸，离心取上清液，加入蔗糖，使得ρ(蔗糖)=50 g/L，加热溶解后冷却，调节pH值至6.5。 1.2 实验方法

1.2.1 PCR扩增及产物测序

收集BD3749菌体，使用试剂盒Tiangen抽提基因组DNA作为后续扩增反应的模板。分别使用引物27-F和1492-R、gyrB-F和gyrB-R，如表1，进行PCR反应，所得产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送样测序。 1.2.2 序列比对及进化树构建

上述PCR产物测得序列使用NCBI 网站BLASTn工具进行序列比对，根据比对结果使用MEGA 6.0进行序列比对并在此基础上构建进化树[24]。进化树的构建参考之前的研究[12]，使用JTT matrix-based模型、采用最大似然法构建。 1.2.3 核苷酸序列

BD3749的16S rDNA序列已提交至Genbank，登记号为KU207096.1。BD3749的基因组数据来源于Genbank(登记号CP014610.1)，进化分析中所用到的其他肠膜明串珠菌的基因组信息均来源于Genbank：

DSM20484(CP012009.1)、KFRI-MG(CP000574.1)、ATCC8293(CP000414.1)、DRC0211(CP013016.1)、J18(CP003101.3)、DSM20241(CP015247.1)。 1.2.4 API 50CH生化鉴定

利用bioMe′ rieux API的50CH鉴定系统测定菌株BD3749发酵碳水化合物的产酸情况；同时测定标准菌株ATCC8293的发酵情况并将两者的结果进行比较。操作按照厂商的说明书进行，受试菌株BD3749及ATCC8293为处于对数生长期的培养物，设置OD600=0.4～0.6。 1.2.5 生长曲线及活菌数测定

将MRS中培养过夜的BD3749种子液按1∶50的质量比例转接于新鲜的番茄汁培养基中，置于30 ℃培养箱中160 r/min振荡培养。按设定的时间点取样测定OD595，根据OD值变化绘制生长曲线。同时样品经梯度稀释后均匀涂布于MRS平板(每个样品做3次重复)，置于厌氧箱中培养48 h后进行菌落计数，通过所得的活菌数量绘制活菌数变化曲线。 1.2.6 发酵过程中产EPS量分析

对BD3749发酵过程中不同时间点EPS样品的制备方法参考之前的研究[12-13]，具体地，对可溶性多糖的测定，将发酵液以8 000 r/min离心10 min，取上清，缓慢加入3倍体积的无水酒精(边搅拌边加入)，4 ℃静置2 h后1.5×104 r/min离心10 min，收集所得沉淀，经冷冻干燥后称重即得可溶性胞外多糖(soluble EPS,sEPS)的量；而对于不溶性胞外多糖(insoluble EPS, iEPS)，将发酵液冻干后，将冻干粉末与2 mol/L的NaOH溶液以1 g∶4 mL的比例混合室温浸提2 h，1.5×104 r/min离心10 min，取上清，用2.5 mol/L的HCl溶液调节pH值至

7.0，1.5×104 r/min离心10 min取沉淀，冷冻干燥后称重即得水不溶性胞外多糖的量。发酵液中残留的蔗糖的量由上海必诺检测技术服务有限公司以高效液相色谱的方法进行测定；发酵过程中的pH值使用德国Sartorius公司PB- 100型pH计进行测定。

1.2.7 不同装液量对产EPS量的影响分析

使用250 mL锥形瓶，预装入不同体积的番茄汁培养基：10，20，40，80，100，200 mL。将BD3749种子液按1∶50的质量比接种于上述培养体系中，30 ℃，180 r/min振荡培养48 h后收取发酵液，按1.2.6节方法对产糖量进行分析。 2.1 BD3749产EPS特性及16S rDNA序列分析

BD3749在产糖培养基中合成大量EPS[25]，发酵24 h形成拉丝性能良好的黏稠状产物。其在

MRS+蔗糖平板上形成包裹菌落的黏性EPS包被，见图1。对液体发酵产物的分析表明，其中包含大量不溶性EPS及水溶性EPS。对肠膜明串珠菌BD3749依据16S rDNA序列进行进化分析，如图2。 2.2 BD3749亚种归属

2.2.1 基于分子生物学的亚种水平鉴定

随着基因组测序技术的迅猛发展，BD3749的基因组序列也已经公布。对BD3749的全基因组序列(CP014610.1)和已知的肠膜明串珠菌基因组信息进行的分析表明，其在基因组水平上与已鉴定的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌株有很高的相似性(基因组水平上的相似性高达92%以上)。进一步利用MEGA 6.0对已知的肠膜明串珠菌4个亚种(肠膜亚种subsp. mesenteroides、右旋糖苷亚种subsp. dextranicum、suionicum亚种subsp. suionicum[26]和乳脂亚种subsp. cremoris)的基因组序列进行了进化分析，结果见图3。BD3749与已知的肠膜明串珠菌肠膜亚种聚为一类，如标准菌株ATCC8293。此外，根据高彩霞等[11]建立的肠膜明串珠菌的亚

种水平上的鉴定方法，对BD3749的gyrB基因进行序列分析结果也表明其为肠膜亚种，见图4。

2.2.2 基于传统生化方法的鉴定

虽然基于分子生物学技术的菌种鉴定已经得到广泛使用，但传统的生化鉴定方法依然是菌种鉴定中的重要标准[2, 27-29]。在上述分子水平的鉴定基础上，我们使用API 50CH鉴定系统，对BD3749不同碳源的发酵特性进行了分析，结果见表2。并同时将其与标准菌株ATCC8293的实验结果进行了比较分析。结果表明BD3749对不同碳源的利用及发酵特性与ATCC8293高度相似，进而从生化水平上确证BD3749为肠膜明串珠菌肠膜亚种[1, 30-31]。根据美国FDA及我国卫生部批文的规定，该菌株属于可以应用于食品中的菌株。 2.3 BD3749在番茄汁中的生长及产EPS情况

已有研究表明，肠膜明串珠菌合成的EPS主要为右旋糖苷dextran[5, 13, 32]，该类EPS能够有效改善食品的质构及稳定性能[33]。而BD3749在产EPS方面与已报道的肠膜明串珠菌不同的，除了水溶性的EPS，其还能产生不溶性的EPS[12-13]。对BD3749的不溶性多糖的研究表明，其主要为不溶性的葡聚糖，能够导致饱腹感且不被人体消化吸收，有望作为无热量的膳食补充剂[14, 16]，在热量摄入过高导致的代谢性疾病普遍发生的当下，可对诸如糖尿病之类的慢性疾病起到干预作用。因此，能够产生该类EPS的肠膜明串珠菌作为发酵剂应用于食品工业，一方面有望通过产生EPS来改善产品的质构特性来减少或者避免各种食品添加剂的使用；另一方面则可以利用其EPS作为膳食补充剂的特点实现对一些代谢疾病的干预。为了探索BD3749在食品中的应用前景，参考之前的研究[13, 15]对其在番茄汁中的生长情况进行了研究。 “+”表示产酸，“-”表示不产酸。 2.3.1 BD3749在番茄汁培养基中生长曲线

对BD3749在番茄汁培养基中的生长曲线测定，见图5。BD3749在ρ(蔗糖)=50 g/L的番茄汁培养基中生长良好，发酵24 h后生物量明显增加，且发酵液pH值显著降低。随着发酵时间的延长(至72 h)，生物量逐渐增加，伴随发酵液pH值不断降低。

2.3.2 BD3749在番茄汁培养基中产EPS情况

肠膜明串珠菌合成的EPS在食品工业中有良好的应用前景，因此，我们对BD3749在番茄汁培养基中的产EPS情况进行了分析，见图6，BD3749利用蔗糖在番茄汁培养基中合成大量EPS，其中主要为不溶性多糖(iEPS)。不溶性多糖的产量最高可达14.5 g/L(发酵48 h)，相比之下，可溶性多糖(sEPS)则相对较低，在发酵48 h后可达约6 g/L。值得注意的是，iEPS的产量在48h以后略有下降，推测可能是BD3749中存在能对其进行分解利用的酶(系)。 2.3.3 不同通氧量对BD3749产EPS的影响

肠膜明串珠菌为过氧化氢酶阴性的兼性厌氧菌，不同浓度的氧气可能对其生长产生影响。此外，之前的研究表明，BD3749负责EPS合成的酶会受通氧量的[12]。因此，我们进一步研究了不同装液量对BD3749产EPS量的影响，见图7。 由图7可知，在相同容器、不同装液量(模拟不同的通氧量)的培养体系中，BD3749的不溶性多糖(iEPS)产量也发生变化。在装液量较少的情况下，iEPS产量会随着装液量的增加而增加，在80 mL装液量时产量达到最高，为14.5 g/L；而装液量超过80 mL时，单位体积的产糖量会随着装液量的增多而降低。与此不同的是，水溶性多糖(sEPS)的产量也没有明显的变化，这与此前在合成培养基中的结果相似[12]。

本研究对肠膜明串珠菌BD3749进行了亚种水平上的鉴定，并对其在食品中的应用做了探索。通过分子生物学及生物化学手段确定了BD3749属于食品中可以使用的肠膜明串珠菌肠膜亚种，在此基础上研究了其在番茄汁培养基中的发酵及产

EPS性能。进一步考察了通氧量对BD3749不溶性多糖产量的影响，并对

BD3749在番茄汁培养基中的产EPS量进行了初步优化，在优化的装液量条件下，iEPS的产量可达14.5 g/L。该条件下合成的iEPS有望作为膳食补充剂应用于食品中，对因能量过剩而引发的代谢性疾病进行饮食干预。

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