最新汇编国家自然科学基金成功中标申请书标书样本讲解标注74

研究研究内容和意义简介：

视网膜缺氧和缺血性疾病（此处似可略去）已成为眼科最常见、难治疗、易复发和易失明的疾病。最近的研究表明，脑红蛋白（Neuroglobin, Ngb）对脑缺血缺氧具有明显的保护作用，本研究拟揭示其对视网膜缺血缺氧是否也有同样的保护作用。具体研究内容包括：（1）研究视网膜不同发育阶段Ngb的表达，并观察Ngb表达与视网膜发育过程中氧的需求和视功能的联系，从而揭示正常生理状况下Ngb与视网膜氧代谢之间的关系；（2）动物模型分别造成急性和慢性视网膜缺氧，进一步证实病理状态下Ngb与视网膜氧代谢之间的关系；（3）增强或减弱Ngb在视网膜内的表达，研究Ngb对视网膜缺氧的保护作用；（4）对培养的视网膜细胞给予低氧环境来诱导细胞的凋亡，观察细胞内Ngb的定位变化及其与细胞色素C的相互关系，初步探讨Ngb保护视网膜缺氧的分子机理（为什么要从此角度研究其分子机理，应在立论依据中说明）。通过以上研究，有望对视网膜缺血和缺氧性疾病的发病机理、预防和治疗提供新的实验依据。

关键词：视网膜、缺氧、脑红蛋白 （一）立项依据与研究内容（4000~8000字）

1．项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状分析，附主要参考文献目录）

流行病学调查表明，视网膜缺氧和缺血性疾病（如视网膜动静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜色素变性等）发病率日益增加，目前已成为除白内障外最常见的致盲原因。而且随着人口老龄化的继续发展，此类疾病的发病率还有继续上升的趋势。但是，由于对其确切的发病机理（尤其是分子机理）还不十分清楚，目前对其治疗和预防的效果均不理想。因此，尽快阐明此类疾病的发病机理、从而寻求更为理想的治疗及预防措施成为亟待解决的重要课题。目前，该课题也成为眼科医生及相关学者的研究重点。

由于视网膜是人体中最大的耗氧组织（是否确切？耗氧率可能是最高的，但耗氧量不应该是），对O2的需求非常敏感，因此很多情况下脑缺氧和缺血的一个非常重要的前兆就是视网膜的缺血。我们知道，视网膜的缺血性疾病，实际上就是视网膜的缺氧。视网膜组织对缺氧非常敏感有着重要的解剖和生理学基础，即视网膜血管的相对稀少和视网膜的高需氧要求。

由于视网膜的氧代谢具有非常重要的临床意义，因此，国外学者对此进行了大量的研究。这些研究结果显示：

首先，视网膜组织在血液供应上有其独特的结构特点，内层视网膜通过动脉系统供氧，其视网膜PO2的平均值为20 mmHg。外层视网膜通过睫状血管系统供氧，后者则必须通过渗透才能保证外层视网膜的供氧。视网膜循环（？）对O2有效的自动可以确保健康动物内层视网膜PO2相对不会受到全身缺氧、氧过多及眼内压增高的影响。视网膜循环的

障碍将导致组织缺氧，成为糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变血管增生的基础。脉络膜血流没有代谢的调节，因此，全身缺氧和眼内压升高将导致脉络膜PO2的下降和光感受器O2的消耗（有何变化？）。同样在高氧的情况下，由于缺乏调节脉络膜内的PO2便会急剧升高，因此增加O2供应可用于对视网膜血管阻塞性疾病和视网膜脱离的治疗（Wangsa-Wirawan and Linsemeier, 2003）。

其次，视觉过程是一个高度耗能的过程，其所需的大部分能量来源于与ATP合成相关的氧化代谢。以单位重量为计，视网膜中氧的消耗明显高于脑（Anderson and Saltzman, 19; Ames, 1992），是体内耗氧率最高的组织(Anderson, 1968)。同时，氧的摄取与其血管的结构明显不成比例（该表述不容易理解，另该情况是视网膜特有还是具普遍性）(Coyle and Puttfarcken, 1993)，而且氧也无法被“贮存”在组织当中，因此，视网膜组织就必须时刻保证有恒定和充足的氧供（Vanderkooi et al., 1991）。这样就使得视网膜要比其他组织更易受到缺血和缺氧的攻击。

尽管科学家们经过了多年的努力，已经对视网膜的上述解剖和生理学特点有了比较系统的认识，但是对于视网膜氧分布和消耗的分子机制却并不清楚，这也是造成多年来视网膜缺氧和缺血性疾病一直无法得到有效治疗的重要原因。因此，只有对视网膜氧分布和消耗在分子水平进行详细的研究，才能在对上述疾病的预防和治疗上有较大的突破。值得庆幸的是，2000年德国科学家Thorsten Burmester和Thomas Hankelin首先在人和小鼠体内发现了一种主要分布在脑内并具有运输O2、促进O2向线粒体内弥散的珠蛋白家族成员——脑红蛋白（Neuroglobins, Ngb）。体内和体外的研究均证明，该蛋白对脑缺氧和缺血性疾病（例如脑中风）有明显的保护作用，从而对脑缺氧和缺血疾病的病因和治疗研究开创了一个新的研究方向。最近的研究表明，Ngb在眼视网膜中的表达比脑组织还要高100倍，是体内表达量最高的组织。结合视网膜的高耗氧量以及Ngb蛋白在生物体内的功能特性，我们有理由认为Ngb在视网膜的氧代谢中可能具有非常重要的生理学和病理学意义。这也为揭示视网膜缺氧性疾病的原因和病理机制提供了一个新的思路。

因此，本课题立足于设想Ngb在视网膜中的表达与视网膜缺氧之间一定存在着密切的关系这个假说。以Ngb作为一个课题研究的中心，希望从多个方面搞清楚Ngb与视网膜氧代谢之间的相互关系，从而阐明视网膜氧代谢的分子机理。在此基础上通过干预视网膜中Ngb的表达和供氧，进一步搞清楚视网膜缺血和缺氧疾病的发病机理，为此类疾病的临床预防和治疗提供重要的参考价值。

建议：

1以上文字修改是按我的行文习惯，供参考；

2对视网膜缺氧和缺血性疾病的发病机理的目前研究进展似应做适当综述； 3对Ngb的研究进展的论述可考虑更充分一些； 4对视网膜供血供氧的解剖基础的叙述似可更简练一些。

5参考文献文内不必标注作者及年代，引用格式与国内期刊通用格式相同，另文献数目最好在20篇以内，大部分应为最新文献。 主要参考文献：

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24. 最新汇编伸出手替他盖好被子，在他的额头浅浅一吻，眼角的泪水滑落在飞旋的脸庞。飞旋的眉头轻

轻皱了起来，就“何莞你还是那样，波澜不惊，其实你刚刚在门口看到我时发了一会楞，你看到了我，一定在想，他怎

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纸画完

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30. ?第二天接着寻找，知道了他大学中途退学，去了省城，去了北京，上海，武汉等地，但还是没找到人， 31. 向雨，我要走了，请你不要孤单，我会陪着你一起度过这荒凉的岁月。 32. Karakucuk, S. and Mirza, G.E. (2000) Ophthalmic Res. 32, 30-40 33. Schmidt, M., Giebl, A., Laufs, T., et al. (2002) JBC in press.

34. Carter-Dawson, L.D. and LaVail, M.M. (1979) J. Comp. Neurol. 188, 245-262

2．研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题：

1． 视网膜不同发育阶段Ngb的表达 内容：

（1）定量检测大鼠生后不同时间点P0（出生）、P3、P7（此期出现大量视网膜节细胞调亡）、P14（大鼠开始睁开眼睛）、P28（青春期）大鼠和成年大鼠视网膜内Ngb蛋白和mRNA；

（2）应用微电极技术检测相应时间点大鼠视网膜内的氧分压变化； （3）检测相应时间点大鼠局部视网膜功能（ERG）的变化。 目标：揭示生理状态下Ngb表达与视网膜耗氧量之间的关系。 拟解决的关键问题：（为何是关键问题、如何解决应做适当论述） （1）幼年大鼠视网膜内氧分压及其正常值的测定。

（2）幼年大鼠视网膜电图（Electroretinogram, ERG）的检测及标准确定。 2． 视网膜缺氧状态下Ngb的表达

内容：制作急性视网膜缺氧及慢性视网膜缺氧模型，定量检测视网膜内Ngb蛋白及mRNA的表达，同时检测缺氧前后视网膜各层的氧分压变化。

目标：明确在视网膜缺氧状态下Ngb的表达变化。

拟解决的关键问题：

规范动物模型的制作方法，与国外的研究一致。 3． Ngb对视网膜缺氧的保护作用： 内容：

（1）构建含大鼠Ngb基因全长的重组腺病毒，注射于大鼠眼底，同时造成该动物视网膜急性或慢性缺氧，观察Ngb的高表达是否对视网膜缺氧具有保护作用（除了观察RGCs的存活与凋亡，有无其它观察手段）；

（2）利用RNA干涉技术，使视网膜Ngb基因表达“沉默”，观察在此情况下正常及缺氧视网膜的变化。

目标：确定Ngb是否对视网膜缺血缺氧具有保护作用。 拟解决的关键问题：

（1）Ngb重组腺病毒的构建：作为在体基因转染的载体，关键在于减小其免疫原性并提高转染体内细胞的效率，本研究拟采用AdEasy腺病毒载体系统，其具有重组效率高、重组腺病毒免疫原性低等优点，用此系统课题组成员已成功构建了BDNF及TGF-ß1重组腺病毒；

（2）RNA干涉技术：RNA干涉是最近发现的因双链RNA的作用，可使特定基因沉默从而丧失功能的现象，随着对其机制的逐渐阐明及相关技术的不断完善，该技术逐渐成为基因功能研究的强有力工具。课题组成员在此方面已积累了部分经验，为达到在体应用的目的，必须寻找理想的转染载体，一方面要保证siRNA及前体双链RNA的稳定性，同时保证转入目标细胞的效率。我们拟构建特定的表达质粒，使其在目标细胞中表达siRNA。

4． 初步探讨Ngb表达保护视网膜缺氧可能的分子机制：

文献提示，Ngb蛋白在视网膜中与其mRNA的分布并不一致，Ngb蛋白而主要定位于作用细胞的线粒体内。这表明随着视网膜细胞功能的不断成熟，Ngb也显示出其独特的亚细胞定位。另一方面，神经元细胞缺氧后的死亡大都是通过细胞调亡途径来实现的。由此我们设想Ngb保护视网膜的缺氧可能与视网膜神经元细胞的调亡过程有关，而神经元细胞调亡其中一个重要的机制就是所谓的线粒体机制，即通过细胞色素C的途径来导致细胞的调亡的。因此，我们通过对培养的RGCs给予一定的低氧环境，观察该细胞体内Ngb的亚细胞分布变化及其与细胞色素C的相互关系，借此来验证Ngb阻断RGCs凋亡发生的分子机理是否是线粒体机制。（以上内容可在立论依据中反映，此处明确提出研究的内容和目标即可）

研究方法：

（1）RGCs细胞培养；

（2）细胞调亡技术 （3）免疫细胞化学技术 （4）电镜技术 拟解决的关键问题：

（1） RGCs细胞的培养

3．拟采取的研究方案及可行性分析（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

（1）大鼠视网膜中Ngb的表达： 主要技术路线：

大鼠正常视网膜中Ngb的表达 ↓

生后不同发育时期视网膜中Ngb的表达 ↓ ↓ ↓

Western Blotting 免疫细胞化学 原位杂交技术 ↓ ↓ ↓

视网膜内Ngb蛋白总量 视网膜内Ngb的分布 视网膜内Ngb mRNA的分布 关键技术说明及可行性分析：

① 大鼠视网膜的Ngb检测无论是上述何种方法都是成熟的技术。Thorsten Burmester等人已经在成年大鼠的脑内和视网膜内进行了上述实验。

② 对于生后发育大鼠视网膜Ngb的检测，主要是选择好固定方法。研究者在大鼠脑组织生后发育的研究中已有较多的经验（见研究者有关发表的文献）。

③ Ngb抗体和探针已经由合作单位克隆完成并已用于大鼠脑缺氧Ngb表达的研究。 （2）大鼠视网膜各层中氧的分布和局部ERG 主要技术路线：

大鼠 → 麻醉 → 睫状体部刺入氧电极

↓ 同时检测 ↓

正常视网膜中氧分压 正常局部视网膜电图

↓ 生后不同发育时期视网膜中氧分压和局部ERG 关键技术说明及可行性分析：

① 具体方法和原理见附件，已经是一个比较成熟的技术。

② 微电极由双针电极组成，其中一个针电极用来检测视网膜各层的氧分压（PO2），另一个针电极用来检测局部的视网膜电图（ERG）。 ③ 微电极由一个微型驱动器以不连续的方式（一次推进3 μm的幅度）由玻璃体开始穿透视网膜，最后穿出脉络膜。之后，将电极缓慢退出到玻璃体，并且边退出边记录。退出的速度为2 μm/s。目的是保证记录时视网膜组织和血管没有被挤压。

④ 关键是对于生后不同发育时期大鼠的视网膜微电极记录时一定要与视网膜各个层次的厚度一一对应，否则可能会产生与成年大鼠之间无法分析的结果。

（3）视网膜急性缺血的动物模型： 主要技术路线：

成年大鼠 → 全身麻醉 → 暴露视神经 → 剪开视神经鞘膜 ↓

大部分阻断眼动脉 ← 分离出眼动脉 ↓ 检测 ↓

视网膜中氧分压 视网膜中Ngb表达 ↓ ↓

建立二者之间的相互关系 关键技术说明及可行性分析：

① 采用可控制的自闭式微血管钳夹闭眼动脉，维持视网膜仍然有一定的血流量，并且时间不宜太长。

② 课题的申请者长期从事视神经损伤的研究，对于眼动脉的解剖部位很清楚。此时应注意避免损伤视神经。

（4）视网膜慢性缺血模型的建立： 主要技术路线：

成年大鼠 → 全身麻醉 → 分离眼外肌 → 暴露眼球 ↓

电凝或烧灼3根蜗状静脉 ↓ 观察 ↓

眼压 视网膜中C/D值 ↓ ↓

建立大鼠慢性青光眼的动物模型 关键技术说明及可行性分析：

① 通过需要3周左右的时间才能建立该模型，此间每日应观察眼压、3天检查C/D值。还可以通过RGCs细胞的逆行标记技术观察青光眼对RGCs的损害程度。

② 该动物模型目前已成为国外公认的比较符合病理特征的慢性青光眼模型。方法简单，效果可靠。

③ 课题申请者曾经使用过该模型用于视神经慢性损伤的研究。 （5）大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）存活率的检测： 主要技术路线：

大鼠急性或慢性视网膜缺氧模型 → 大鼠麻醉 → 置于头颅立体定位系统

↓

荧光显微镜下RGCs记数 ← 视网膜固定、平铺 ← 上丘注射荧光金或DiI追踪剂 关键技术说明及可行性分析：

① 大鼠上丘逆行标记技术是研究视神经损伤的常用而基本的技术。

② 立体定位的坐标通常采用George Paxinos & Charles Watson编写的《The Rat Brain in Stereotaxic Coordinate》图谱进行定位注射。 （6）Ngb重组重组腺病毒制备： 主要技术路线： Ngb酶切 PTrack-Ngb NgbNgb

大肠杆菌内同源基因重组 Ngb重 组质 粒

片段连接 腺病毒基因组（1）本实验主要主要涉及质粒的转化、扩增、提取、酶切及基因片段的连接等分子生物学实验技术，已被课题组相关成员熟练掌握； 转移

载体关键技术说明及可行性分析： PAdEasy （2）应用上述腺病毒载体系统我们已成功制备了BDNF及TGF-ß1重组腺病毒。

4．项目的特色与创新之处

（1）本项目通过脑红蛋白（Ngb）作为视网膜缺血缺氧研究的一个突破口，目的是解决视网膜缺血缺氧病理基础中的分子机理问题。因此，本项目将Ngb的表达作为一个视网膜缺氧研究的核心和线索是最重要的创新之处。

（2）本项目结合视网膜各层组织内氧分压的检测、局部ERG的检测和Ngb的表达检测全面地研究Ngb与视网膜氧供之间的关系。所采用的技术方法先进而且将这些技术方法与视网膜的缺氧研究很好地结合到的一起。

（3）通过采用分子生物学的手段增加和减弱Ngb的表达，能够比较好地进一步证明Ngb对视网膜缺氧的保护作用。

) 重组腺病毒基因组293细胞内包装 重组腺病毒 PAdTrack-CMV () ( （4）选用视网膜神经节细胞（RGCs）在细胞和亚细胞水平初步探讨Ngb阻断RGCs细胞缺氧所致细胞凋亡的确切机制。

（5）选择合适的动物模型与临床应用进行了有机的结合。

5．年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）

（1）2005年 1． 完成Ngb在成年和生后不同时期表达的研究。 2． 建立视网膜微电极技术并完成初步的实验。 3． 建立视网膜缺血的动物模型。 （2）2006年

1． 全面完成视网膜微电极检测视网膜内氧分压和局部视网膜ERG的实验。 2． 通过基因转染技术将Ngb转染到病毒内并能够明显地提高视网膜内Ngb的表达。 3． 应用反义RNA技术并能够使得大鼠视网膜内Ngb表达明显减弱。 4． 全面完成大鼠视网膜缺血动物模型的各项实验。 （3）2007年

1． 完成视网膜神经节细胞在大体水平受缺氧损伤以及Ngb表达对其损伤保护的研究。 2． 完成RGCs细胞中缺氧其凋亡以及Ngb阻断凋亡的机理研究。 3． 完成剩余的研究工作并提交研究报告。

（二）研究基础与工作条件

1． 工作基础（与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）（工作基础的

叙述应尽量栩实）

（1）合作单位（军事医学科学院）已完成Ngb蛋白的提纯、分离和克隆（应为Ngb基因的克隆）；Ngb mRNA的测序及探针的合成和标记等工作。 （常规方法，可不说）

（3）实验室已完成视网膜神经节（RGCs）的培养，并能够根据细胞内的蛋白标记物而进行细胞的鉴定与分离。

（4）在针对缺血性视神经病变的研究过程中，我们已能够在大鼠眼中通过特异性的钳闭视网膜动脉3分钟后再灌流而建立了眼动脉阻塞的动物模型。通过在巩膜上烧灼3根涡静脉而成功地建立了慢性青光眼的动物模型，该模型经过眼压检测、眼底视盘凹陷测量以及视觉电生理检查等均显示达到了国外文献相似的动物模型标准。

（5）本科室已应用国产的视觉电生理检查系统完成了大鼠视网膜电图（ERG）和视觉

诱发电位（VEP）检查工作，能够间接地判断视网膜整体的功能状态和缺血程度。 2． 工作条件（包括已具备的实验条件、尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用

国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。） （1）已具备的实验条件：

我院的中心实验室具备大鼠的动物饲养、免疫细胞化学、原位杂交技术、Western Blotting技术以及细胞培养的工作。

本科室的实验室能够完成大鼠的ERG检测及分析工作；能够完成大鼠动物模型的制作；能够完成大鼠脑立体定位注射和逆行标记技术。 （2）尚缺少的实验条件：

本研究中的视网膜氧微电极检测工作需依靠军事医学科学院和第四军医大学神经科学研究所的电生理研究室来完成。

本研究中的基因转染等分子生物学、电镜等方面的工作需要依靠合作单位军事医学科学院来完成。

部分实验工作可以得到大学医学院苏国辉教授的实验室指导和帮助。 3． 申请人简历（包括申请人和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期发表与本

项目有关的主要论著和获得学术奖励及在本项目中承担的任务。）

（1）申请人李耀宇，1985年本科毕业于第四军医大学，1991年硕士毕业于第四军医大学眼科专业，其间所完成的课题为“直肌离断致眼前节缺血的病因、病理机制及防治的系列研究”。该课题已于2001年获得科学技术进步二等奖。1999年博士毕业于第一军医大学神经生物学专业，其间所完成的课题为“直肌离断致眼前节缺血的病因、病理机制及防治的系列研究”。该课题已于2001年获得科学技术进步一等奖（研究生课题应是获奖课题的一部分，应指明）。之后，在第四军医大学全军神经科学研究所做博士后工作，其间在导师鞠躬院士和大学医学院苏国辉院士的指导下从事视神经损伤后的再生研究。其间发现嗅神经鞘细胞和神经干细胞移植到视神经后呈极性迁移的特性，该内容在第二届亚太地区神经再生大会上进行了大会报告，引起了国外学者的重视。2001年毕业后任北京军区总医院眼科副教授、副主任医师。2003年成为军医进修学院的硕士研究生导师，《人民军医》杂志编委。

（2）课题组成员：

李欣：男，1974年11月出生，军事医学科学院基础医学研究所博士研究生，硕士课题为“大鼠脊髓原代神经元损伤模型的建立及脊髓原代神经元损伤相关基因的克隆和分析”，现从事脊髓损伤相关基因的功能研究，电话66932379，E-mail: lixin1974@hotmail.com;

赵敏：女，1978年1月出生，军事医学科学院基础医学研究所硕士研究生，电话66932379，

E-mail: sd-zhaom@sohu.com.

4． 承担科研项目情况（申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况，包括自然

科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、负责的内容等。） 5． 完成自然科学基金项目情况（对申请者负责的前一个） （三） 经费申请说明 （四） 其他附件清单

经费申请表： （金额单位：万元）

科 目 一、研究经费 1．科研业务费 （1）测试/计算/分析费 （2）能源/动力费 （3）会议费/差旅费 （4）出版物/文献/信息传播费 （5）其他 2．实验材料费 （1）原材料/试剂/药品购置费 （2）其他 3．仪器设备费 （1）购置 （2）试制 4．实验时改装费 5．协作费 二、国际合作与交流费 1．项目组成员出国学术交流 2．境外专家来华交流 申请经费 16.75 3.80 1.50 0.55 0.80 0.45 0.50 5.50 5.00 0.50 3.50 2.40 1.10 1.50 2.40 3.50 2.50 1.00 做何分析，要说明 主要材料要列出 欲购何仪器，要说明 做何种改装 何用途？ 有何意向？应说明 备注（计算依据及说明） 三、劳务费 四、管理费 合 计

1.80 2.20 24.20 具体用途？